MARVELD1假定RCC1结构域确认与功能研究

来源 :哈尔滨工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tony_one
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MARVELD1基因的转录本mRNA全长3238bp,编码蛋白分子量为18kDa的新候选抑癌基因。在前期研究中发现,MARVELD1在多种肿瘤细胞或组织中表达存在显著下调现象。MARVELD1在调控细胞周期、细胞增殖、细胞侵袭与迁移、细胞凋亡和DNA损伤修复等过程中发挥重要作用。RCC1在细胞增殖、细胞周期调控、纺锤体形成、DNA复制和核膜重塑等过程中亦起到重要作用。RCC1(Regulator of chromosome condensation-1)是目前发现的细胞中唯一一个RanGEF(Ran Guanine Exchange Factor)分子,其可催化Ran的活性形式RanGTP水平的上升。生物信息学的蛋白质结构域预测分析提示,MARVELD1蛋白具有一个RCC1同源结构域,因此,本课题探讨了MARVELD1与RCC1的功能上相关性。  本研究首先采用免疫荧光共定位的方法发现,MARVELD1在细胞中与Ran存在着明确的共定位现象。而缺失RCC1同源结构域的截短体MARVELD1-RCC1与Ran进行免疫荧光共定位发现共定位现象消失,提示该结构域在MARVELD1与Ran相互作用中的必要性。利用免疫共沉淀技术分析MARVELD1与RCC1和Ran的相互作用,结果表明MARVELD1与GTP结合形式的RanGTP存在相互作用,而与RCC1存在较弱的相互作用。此外,构建了pGEX-6P-1/RanBP1重组体,并通过GST-pull down技术,证实了MARVELD1与RanGTP之间的相互作用。  随后,本文通过基因沉默或过表达MARVELD1的方法,分析了MARVELD1对RCC1和Ran表达的影响,发现MARVELD1的表达对RCC1的表达存在正相关的调控,但对Ran的表达没有影响。接着本研究使用RNAi技术对MARVELD1、RCC1和Ran进行表达沉默及DAPI染色观察。结果显示,MARVELD1、RCC1或Ran的表达沉默,均可造成细胞分裂异常,且Ran沉默组细胞出现大量细胞死亡,表明MARVELD1可能参与RCC1和Ran调控的细胞有丝分裂过程。经进一步对染色后荧光强度的统计发现,MARVELD1和RCC1可能在染色质凝集过程中行使相似功能。  综上,本文证明了MARVELD1与RanGTP存在相互作用关系,并确定了其中假定的RCC1结构域的存在。
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