前言：　　Diversin也被称作锚蛋白重复序列包含蛋白6(ANKRD6)，它是果蝇属Diego蛋白在哺乳动物中的同源异构体，同时参与经典Wnt/beta-catenin通路和非经典Wnt/JNK通路（即PCP通路）。而Diego则是PCP通路的核心蛋白，它与Fz-Dsh信号相关。研究发现在新生小鼠和成鼠脑内，Diversin表达于室下区和海马区的神经母细胞和成熟神经元，并证实Diversin可以促进其增殖活性。在胚胎发育过程中Diversin通过非经典Wnt/JNK通路调节斑马鱼胚胎的原肠胚运动以及控制心脏前体的融合。Diversin作为一个分子开关，可以抑制经典的Wnt/β-catenin通路，促进非经典的Wnt/JNK通路。另外，Diversin含有一些核定位信号，转移入核后可以和转录因子AF9相互作用，而AF9能够显著增加Diversin引起的JNK活性增加。Wnt和PCP信号成员可以调控Diversin的亚细胞定位从而影响其在通路中的作用。Diversin蛋白位于细胞的中心小体，这种独特的细胞器以及衍生的纤毛在许多信号通路，包括Hedgehog, Wnt，PDGF和FGF中扮演了重要的角色。　　目前Diversin在人类肿瘤中的表达情况及意义尚不清楚，其是否具有调控肿瘤细胞增殖或侵袭的能力及分子机制等都有待于进一步探讨。在本研究中，我们用免疫组化和western blot等方法检测了Diversin蛋白在肺癌组织和细胞系中的表达，通过双向调控Diversin的表达，分别检测Diversin对经典和非经典Wnt通路中重要蛋白的影响，初步探讨了Diversin对肺癌细胞增殖侵袭的影响和可能的作用机制。　　材料与方法：　　一、组织标本与患者资料　　167例非小细胞肺癌(NSCLC)组织和38例癌旁正常肺组织均来自于中国医科大学附属第一医院病理科2004-2006年存档蜡块。在167例肺癌病例中具有完整随访资料的74例。随访是从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。患者（106例男性，61例女性）年龄29-81岁，中位年龄60岁。根据第七版国际抗癌联盟肺癌TNM分期标准，Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ期74例，Ⅳ期5例。根据WHO2004肺癌组织学分类标准，腺癌94例，鳞癌73例。所有患者术前均未接受化疗或放射治疗。为用于蛋白质分析，另收集20例新鲜的肺癌组织及相对应的癌旁正常的肺组织，保存在-70℃冰箱内。　　二、免疫组织化学染色　　手术切除的组织均经过10％中性福尔马林固定后，石蜡包埋，制成4μm切片，采用SP免疫组化法进行染色。一抗使用鼠源性的Diversin，以1∶100(Anti-Diversin购于Santa Cruz Biotechnology， USA)4℃孵育过夜。以PBS代替一抗作为空白对照。生物素标记的二抗IgG(Fuzhou，China)37℃孵育20min，DAB显色。结果判定:每张切片随机选择5个视野，每个视野计数100个瘤细胞。根据计数细胞着色的百分比，将Diversin的表达划分为5个等级:无着色为0分，1％-25％为1分，26％-50％为2分，51％-75％为3分，76％以上为4分。再根据细胞着色的强度，将Diversin的表达划分3个等级:无着色为0分，浅黄色颗粒为1分，深黄色或者黄褐色颗粒为2分。将二者相乘，所得乘积即为该切片的最终得分。Diversin阳性表达定位于胞浆和胞膜。根据38例正常的支气管上皮染色后，其得分均为＜3分，于是实验中将得分＜3分的计为阴性表达（正常表达），而得分≥3分的计为阳性表达（高表达）。　　三、细胞培养　　A549，H1299 and H157细胞系购于美国标准细胞培养所(Manassas,VA，USA);SPC-A-1、LTEP-A-2和正常支气管上皮细胞系HBE购于上海细胞库（Shanghai，China）;PG-BE1和PG-LH7由北医郑杰教授馈赠。细胞培养基采用RPMI1640(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，其中含10％热灭活新鲜小牛血清(Invitrogen)，用25cm培养瓶在5％CO2培养箱中培养，每两天用0.25％胰酶(Invitrogen)消化传代。　　四、质粒构建与转染　　pcDNA3.1-HA-Diversin质粒由Walter Birchmeier教授(Max Delbrueck-Centerfor Molecular Medicine，Berlin，Germany)惠赠。 Diversin siRNA由上海吉玛合成，转染试剂lipo2000购于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA).siRNA干扰序列如下:ANKRD6-HOMO-2171:5GAGGCACUCAAACUAAGAATT3,5UUCUUAGUUUGAGUGCCUCTT3ANKRD6-HOMO-1428:5GAACCUGCAUGCUCAUAAUTT3,5AUUAUGAGCAUGCAGGUUCTT3ANKRD6-HOMO-883:5GCGCGCUAUAAUCACUUGUTT3,5ACAAGUGAUUAUAGCGCGCTT3NC:5UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3,5ACGUGACACGUUCGGAGAATT3。　　五、Western Blotting　　将收集的培养细胞或剪成2mm的肺癌组织块用细胞裂解液(Pierce，Rockford，IL，USA)裂解后提取总蛋白，用Bradford method进行定量，10％SDS-PAGE电泳，上样量为80ug，转印到PVDF膜(Millipore, Billerica，MA，USA)，一抗4℃过夜，二抗37℃，2h，ECL发光后，Bio-Image system(EpiChemiⅢ Darkroom，UVP)进行条带灰度值测定，以与GAPDH的比值作为相对表达量。实验重复三次取均值。　　六、Real-Time PCR　　使用ABI7900实时定量PCR仪，采用SYBR primescript RT-PCR KitⅡ(TakaraBiotechnology)进行反转录和PCR反应。反应条件为95℃ for30 see，40 cycles of95℃ for5 sec,60℃ for30 Sec。　　七、MTT　　在96孔板中用含10％血清的培养基培养约4000个左右的转染24小时后的LTE、H1299细胞，每个孔加入50微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液，在37℃孵育4小时后，去除溶液，用150微升的DMSO溶解生成的MTT结晶，用分光光度计检测550nm波长的吸收峰值进行定量。　　八、细胞基质胶侵袭实验　　在24孔板中以双无的1640培养基按照1∶3的比例稀释基质胶(BDBiosciences)，铺8微米孔径的上室(Costar)。然后将转染48小时后的LTE、H1299以100微升含有3×105个的细胞密度接种在上室并孵育。下室放含有10％小牛血清的培养基。6小时后，加入JNK抑制剂(SP600125)30μM。孵育20小时后，甲醇固定15分钟，苏木素染色。随机选取10个视野，计数侵袭到小室下的细胞数。实验重复三次，取平均值。　　九、统计学分析　　所有的数据采用SPSS17.0版本进行统计学分析。采用Chi-Square检验Diversin表达与临床病理因素之间的关联。采用t检验检测Western Blot结果中的灰度值。采用Kaplan-Meier法检测Diversin对患者生存时间的影响。P＜0.05作为有统计学意义。　　结果：　　一、Diversin蛋白过表达与非小细胞肺癌分化、分期、淋巴结转移和不良预后有关　　免疫组化结果显示38例正常肺组织中Diversin均为阴性表达，而肺癌组织中Diversin阳性率为67.67％(113/167)，二者具有明显的差异(P＜0.001)，并且其高表达与非小细胞肺癌的低分化（高分化:中-低分化P=0.006）、高p-TNM分期(Ⅰ-Ⅱ∶Ⅲ-Ⅳ P=0.030)、淋巴结转移(P=0.048)和不良预后（Kaplan-Meier生存分析，P=0.007）密切相关。Western blot结果显示在7种肺癌细胞系中5种diversin蛋白表达明显高于正常支气管细胞系HBE;在20对非小细胞肺癌新鲜配对组织中，有14例癌表达高于癌旁组织(70％)。　　二、转染Diversin促进非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭　　我们在diversin表达相对较低的肺癌细胞系LTE中转染diversin质粒，而在表达相对较高的肺癌细胞系H1299中转染特异性siRNA，发现转染48小时后，与转染空质粒的细胞相比，转染diversin质粒的细胞在增殖能力（0.51±0.02 VS0.69±0.01 P＜0.05）和侵袭能力明显增强(12±2 VS45±5 P＜0.05)。而转染特异性siRNA的细胞，增殖能力明显下调（0.63±0.02 VS0.53±0.01 P＜0.05），侵袭能力也出现了明显抑制(97±5 VS44±6 P＜0.05)。　　三、Diversin通过JNK促进肺癌细胞增殖与侵袭能力　　转染diversin质粒的肺癌细胞P-JNK/JNK水平明显增加，而P-P38/P38、beta-catenin和TCF-4变化不大;相反在转染特异性siRNA的肺癌细胞P-JNK/JNK水平明显降低，而P-P38/P38、beta-catenin和TCF-4也没有显著变化。我们在转染diversin质粒后又加入JNK抑制剂SP600125（30μM），这时磷酸化JNK水平受到明显抑制，此时MTT检测结果发现肺癌细胞增殖能力明显减弱(DMSO0.51±0.03 VS0.59±0.02;SP6001250.48±0.02 VS0,49±0.03)，同时transwell检测结果发现细胞的侵袭能力亦受到明显抑制（DMSO11±3 VS43±4;SP6001259±2VS14±3）。　　结论：　　1、Diversin在NSCLC组织中高表达并与患者的不良预后相关。　　2、转染Diversin可促进NSCLC细胞的增殖和侵袭。　　3、Diversin通过JNK发挥促进NSCLC细胞增殖和侵袭能力的。