背景在急性冠状动脉阻塞发生后,虽然恢复血流灌注是挽救缺血心肌的最有效方法,但其亦可导致心肌组织损伤加重,这种现象被称之为心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI),是导致缺血性心脏病患者残疾甚至死亡的主要原因。因此,如何避免或减少器官或组织IRI—直是临床医生面临的重要挑战。糖尿病是缺血性心脏病患者常见的合并症,与急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后的高死亡率密切相关。现有的证据表明,糖尿病可增加心肌对IRI的易感性,并通过破坏在抗细胞死亡中具有重要作用的细胞内信号传导而影响MIRI的严重程度。由PI3K/Akt信号转导通路构成的促生存蛋白激酶(pro-survival protein kinases)级联反应是再灌注损伤救援激酶途径(reperfusion injury salvage kinase pathway,RISK途径)的重要组成部分,因此PI3K/Akt信号转导通路激活可保护心肌免受致死性IRI。研究发现,糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是PI3K/Akt信号转导通路下游的重要组成部分。在糖尿病MIRI研究中发现,相关干预心肌保护作用减弱或消失主要是归因于RISK途径功能障碍,并且胰岛素缺乏或抵抗亦与RISK途径功能的改变密切相关。胰岛素可通过促使Akt中的Thr308和Ser473位点磷酸化导致Akt活化,活化的Akt通过GSK-3β磷酸化而抑制线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放。胰岛素缺乏或抵抗可明显影响PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路的功能状态。虽然PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路在糖尿病MIRI中可能发挥着重要作用,但具体机制目前尚不明确。Apelin/APLN是由人染色体上APLN基因产生的一种多肽,是APJ受体的内源性配体。Apelin及其受体APJ在各种组织中广泛表达,特别是心血管系统。Apelin的C端原蛋白可经过内质网(endoplasmic reticulum)剪切形成不同长度的活性多肽。不同长度的Apelin活性多肽在不同代谢途径中的活性各异,其中对Apelin-13的研究目前最为广泛。在正常大鼠Langendorff离体心脏灌注模型的研究表明,应用外源性Apelin-13可通过诱导ERK1/2和Akt磷酸化而增强一氧化氮合酶(nitric oxide synthase)表达,最终减轻MIRI。采用正常大鼠在体MIRI模型的研究发现,Apelin-13可通过PI3K/Akt、AMPK和ERK等信号转导通路抑制MIRI过程中内质网应激诱导的细胞凋亡,而且,Apelin-13可通过PI3K/Akt/GSK-3β/mPTP信号转导通路抑制线粒体膜电位降低而对MIRI产生心肌保护作用。这些结果提示,Apelin-13可通过多种途径对正常MIRI发挥保护作用。现有的研究表明,Apelin与糖尿病密切相关。Apelin可通过增加心肌血管生成、葡萄糖摄取和胰岛素敏感性而改善糖尿病患者的心功能状态,表明Apelin在糖尿病相关的心功能障碍治疗方面具有一定的潜力。但是,关于Apelin-13对糖尿病MIRI的影响目前很少有研究涉及。众所周知,缺血性心脏病的相关危险因素(例如高血压、高胆固醇血症、糖尿病和高龄等)能明显影响各种干预措施对MIRI的保护作用。虽然目前有证据表明Apelin-13对正常MIRI具有明显的保护作用,但是目前尚无研究确定Apelin-13对糖尿病MIRI是否具有保护作用。考虑到Apelin-13的心肌保护作用必须在具有缺血性心脏病危险因素的病理动物模型上获得验证才可能被有效地应用于临床,我们设计了这一随机对照实验,通过比较Apelin-13对正常和糖尿病大鼠MIRI、心肌细胞凋亡、心肌组织学和相关信号转导通路的影响,旨在明确Apelin-13对糖尿病MIRI的保护作用及其相关的机制,尤其是细胞凋亡和PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路在Apelin-13对糖尿病MIRI保护效应中的具体作用和地位。本实验共分4个部分:第1部分实验糖尿病大鼠模型的建立本部分实验的目的是建立糖尿病大鼠模型,采用雄性Sprague Dawley大鼠腹腔注射链脲佐菌素复合喂养高脂高糖饲料的方法,通过连续测定喂养期间大鼠的体重和血糖水平以及进食量、饮水量、尿量、精神状态和皮毛光泽度等,确定糖尿病模型建立是否成功。正常大鼠给予维持饲料进行lw的适应性饲养,测量体重,尾静脉抽血测定随机血糖水平记录为基础值。大鼠禁食12 h,不禁水,腹腔注射与糖尿病造模大鼠相同体积的柠檬酸缓冲液,随后继续给予维持饲料喂养8 w,并在记录基础值48 h后、2 w后、4 w后、6 w后和8 w后分别测量体重和随机血糖水平。建立糖尿病大鼠模型,8周龄的雄性SD大鼠,给予高脂高糖饮食进行lw的适应性饲养,测量大鼠体重、尾静脉抽血测定随机血糖水平为基础值,随后进行糖尿病造模。建模前禁食12 h,不禁水,腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,50mg/kg)。STZ腹腔注射48h后,尾静脉抽血测定随机血糖水平,以血糖水平≥ 16.65 mmo1/L作为糖尿病大鼠建模成功标准。建模成功的糖尿病大鼠继续高脂高糖饲料喂养8 w用于随后实验,并于记录基础值48 h后、2w后、4w后、6w后、8 w后分别测量体重和随机血糖水平,保持随机血糖水平≥ 16.65 mmol/L。结果显示,喂养期间正常和糖尿病大鼠的体重均呈增长趋势。2w时,正常大鼠体重明显高于基础值;4 w、6 w和8 w时,正常和糖尿病大鼠体重均明显高于基础值。正常大鼠48 h、2 w、4 w、6 w、8 w的随机血糖水平与基础值相比差异无显著统计学意义。而糖尿病大鼠48 h、2 w、4 w、6 w、8 w的随机血糖水平明显高于基础值和正常大鼠。第2部分实验Apelin-13对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护作用的实验研究本部分实验的目的是通过比较Apelin-13对正常和糖尿病MIRI的影响,评价Apelin-13对糖尿病MIRI的保护作用。采用30只健康雄性SD大鼠和30只糖尿病大鼠建立在体MIRI模型,分别随机分成三组(每组10只):正常空白对照组(C组)、正常IRI组(IRI组)、正常Apelin-13组(A组)、糖尿病空白对照组(DC组)、糖尿病IRI组(DIRI组)和糖尿病Apelin-13组(DA组)。所有大鼠开胸后丝线穿过左冠状动脉前降支(left anterior descending coronary artery,LAD)做成活结。除 C 组和 DC 组外,所有大鼠均接受局部心肌缺血30 min(阻断LAD)和再灌注120 min(开放LAD)处理。C组和DC组无干预措施。IRI组和DIRI组建立在体MIRI模型。A组和DA组于再灌注开放LAD前经颈静脉按照0.1 mg/kg注射Apelin-13溶液。实验过程中,连续监测心率(heart rate,HR)、平均动脉压(mean arterial presure,MAP)和Ⅱ导联心电图(ECG)。再灌注120 min时留取血液标本,采用大鼠专用酶联免疫试剂盒分别测定血清心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin I,cTnI)和血清肌酸激酶 MB 型同工酶(creatinine kinase isoenzyme MB,CK-MB)。随后采用伊文氏蓝(Evan’s Blue)和氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)双重染色检测心肌梗死面积(infarctionsize,IS)。结果显示,糖尿病与正常大鼠体重比较差异无显著统计学意义,糖尿病大鼠血糖水平明显高于正常大鼠,心肌缺血前血流动力学参数的基础值和心肌缺血后15 min的血流动力学参数比较差异均无显著统计学意义。心肌缺血1～5 min时,IRI组、DIRI组、A组和DA组HR与基础值相比均明显升高,而MAP和RPP与基础值相比均明显降低。IRI组、DIRI组、A组和DA组之间比较,缺血期和再灌注初期发生VT和VF的大鼠数目的差异均无显著统计学意义。与C组相比,IRI组和A组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS均明显增高;与IRI组相比,A组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS均明显降低,而DIRI组均明显增高;与A组相比,DA组IS明显增高;与DC组相比,DIRI组和DA组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS均明显增高;与DIRI组相比,DA组血清cTnI和CK-MB浓度及IS均明显降低。第3部分实验Apelin-13对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤中细胞凋亡影响的实验研究本部分实验的目的是观察Apelin-13对糖尿病MIRI中心肌细胞凋亡和心肌组织学的影响,旨在确定细胞凋亡在Apelin-13对糖尿病MIRI保护效应中的作用。30只健康雄性SD大鼠和30只糖尿病大鼠建立在体MIRI模型,分别随机分成三组(每组10只),具体分组处理方法同第2部分实验。再灌注后留取缺血区心肌组织标本,分别应用Tunel染色检测心肌细胞凋亡指数(apoptoticindex,AI);取缺血区心肌组织,采用光学显微镜和电子显微镜下观察心肌细胞形态。结果显示,糖尿病和正常大鼠的体重比较差异无显著统计学意义,糖尿病大鼠的血糖水平明显高于正常大鼠。与C组相比,IRI组、A组和DC组心肌细胞AI明显增高;与IRI组相比,A组心肌细胞AI明显降低,DIRI组心肌细胞AI明显增高;与A组相比,DA组心肌细胞AI明显增高;与DC组相比,DIRI组和DA组心肌细胞AI明显增高;与DIRI组相比,DA组心肌细胞AI明显降低。光学显微镜下观察,A组心肌细胞排列稀疏,心肌细胞变性及心肌组织水肿,心肌纤维排列略紊乱,少量炎性细胞浸润,其病理改变程度较IRI组明显减轻;DA组较A组心肌细胞数目减少,亦可见心肌细胞变性和心肌组织水肿,心肌纤维排列略紊乱,少量炎性细胞浸润,其病理改变程度较DIRI组明显减轻。电子显微镜下观察,A组和DA组心肌细胞形态基本正常,肌原纤维结构完整;Z线排列大致整齐;大部分线粒体形态正常,结构完整,线粒体内嵴清晰,排列整齐。第4部分实验PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路在Apelin-13对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护效应中作用的实验研究本部分实验是在正常和糖尿病在体MIRI模型应用PI3K抑制剂,通过比较Apelin-13的心肌保护作用及其对心肌Akt和GSK-3β表达的影响,旨在明确PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路在Apelin-13对糖尿病MIRI保护效应中的作用。采用60只健康雄性SD大鼠和60只糖尿病大鼠建立在体MIRI模型,分别随机分成六组(每组10只):正常空白对照组(C组)、正常IRI组(IRI组)、正常 Apelin-13 组(A 组)、正常 Apelin-13+LY294002 组(A+L 组)、正常 LY294002组(L组)、正常DMSO组(DMSO组)、糖尿病空白对照组(DC组)、糖尿病 IRI 组(DIRI 组)、糖尿病 Apelin-13 组(DA 组)、糖尿病 Apelin-13+LY294002组(DA+L组)、糖尿病LY294002组(DL组)和糖尿病DMSO组(DDMSO组)。除C组和DC组之外,所有大鼠均接受局部心肌缺血30min(阻断LAD)和再灌注120 min(开放LAD)处理。C组和DC组无干预措施,IRI组和DIRI组建立在体MIRI模型,A组和DA组再灌注前静脉注射Apelin-13 0.1 mg/kg,A+L组和DA+L组再灌注前分别静脉注射LY294002 0.3 mg/kg和Apelin-13 0.1 mg/kg,L组和DL组再灌注前静脉注射LY294002 0.3 mg/kg,DMSO组和DDMSO组再灌注前静脉注射0.2%DMSO溶液。再灌注后测定血清cTnI和CK-MB浓度,采用伊文氏蓝和氯化三苯基四氮唑双重染色检测IS,通过免疫蛋白印迹技术(Western Blotting)检测缺血区心肌组织Akt和GSK-3β磷酸化情况,实时荧光定量PCR技术检测缺血区心肌组织中Akt和GSK-3β mRNA表达情况。结果显示,与C组相比,IRI组、A组、A+L组、L组和DMSO组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS明显增高;与IRI组相比,A组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS明显降低,而DIRI组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS明显增高;与A组相比,DA组IS明显增高;与DMSO组相比,DDMSO组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS明显增高;与DC组相比,DIRI组、DA组、DA+L组、DL组和DDMSO组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS明显增高;与DIRI组相比,DA组血清cTnI和CK-MB浓度以及IS明显降低。与C组相比,IRI组、A+L组、L组、DMSO组和DC组心肌p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β比值明显降低;与IRI组相比,A组心肌p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β 比值明显升高,DIRI 组心肌 p-Akt/Akt 和 p-GSK-3β/GSK-3β比值明显降低;与DC组相比,DIRI组、DA+L组、DL组和DDMSO组心肌p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β 比值明显降低;与DIRI组相比,DA组心肌p-Akt/Akt比值明显升高,而心肌p-GSK-3β/GSK-3β 比值的差异无显著统计学意义;与DA组相比,DA+L组和DL组心肌p-Akt/Akt比值明显降低,DL组心肌p-GSK-3β/GSK-3β 比值明显降低,而DA+L组心肌p-GSK-3β/GSK-3β 比值的差异无显著统计学意义。与C组相比,IRI组、A组、A+L组和DMSO组心肌Akt和GSK-3βmRNA表达明显增强,DC组心肌Akt mRNA表达明显增强,心肌GSK-3β mRNA表达明显降低;与IRI组相比,A组和DIRI组心肌AktmRNA表达明显增强,心肌GSK-3βmRNA表达明显降低;与A组相比,DA组心肌AktmRNA表达明显增强;与DC组相比,DIRI组、DA组和DDMSO组心肌Akt和GSK-3βmRNA表达明显增强,而DA+L组和DL组心肌GSK-3β mRNA表达明显增强;与DIRI组相比,DA组心肌Akt mRNA表达明显增强,DA+L组和DL组心肌Akt和GSK-3β mRNA表达明显降低;与DA组相比,DA+L组和DL组心肌Akt和GSK-3β mRNA表达明显降低。结论通过本实验,我们得出以下结论:1.采用腹腔注射链脲佐菌素复合喂养高脂高糖饲料的方法能够成功建立糖尿病大鼠模型。2.Apelin-13对正常和糖尿病MIRI均具有明显的保护作用。3.Apelin-13可明显抑制缺血/再灌注后正常和糖尿病心肌细胞凋亡,明显改善心肌细胞形态学,提示抑制细胞凋亡是Apelin-13对MIRI发挥保护作用的重要机制之一。4.Apelin-13可通过激活PI3K/Akt信号转导通路抑制GSK-3β活性而对正常MIRI发挥保护作用。虽然Apelin-13亦可通过激活PI3K/Akt信号转导通路对糖尿病MIRI产生保护作用,但其并不依赖于GSK-3β活性抑制。5.Apelin-13对正常和糖尿病MIRI的保护作用无明显差异,这可能是由于Apelin-13对糖尿病MIRI的保护作用并不依赖于激活完整的PI3K/Akt/GSK-3β信号转导通路。