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背景食管癌(Esophageal Cancer,EC)是世界八大常见恶性肿瘤之一,预后很差,2008年全球共有407 000人死于EC,其中一半以上在中国。在全球范围内,大多数EC组织学上属食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。ESCC在全球不同的地理位置发病率也大不相同。众所周知的高风险地区从土耳其东部一直延伸至中国北部及西部地区,即所谓的“亚洲食管癌地带”,其他的主要高发地区包括香港、日本、非洲东南部、法国南部和南美的部分地区。在中国,EC是五大常见恶性肿瘤之一,也是第四大致死癌症。2008年中国EC发病率为16.7/100000,共有259 235例新增病例和211 084例死亡病例。EC的重要特征之一是高死亡率,其五年生存率仅为15%-25%,大多数病人在临床上确诊之后的生存时间不超过一年。EC预后不良的主要原因是大多数早期食管癌由于没有明显症状而不易被发现,直到中晚期扩散才有临床症状,然而此时已失去了最佳手术时期。因此,早期发现、早期诊断及早期治疗是降低EC发病率及死亡率的有效手段之一。蛋白质糖基化修饰是最为常见的一种翻译后修饰,人体内约有70%的蛋白发生了糖基化修饰。糖蛋白的寡糖侧链在细胞与细胞间、细胞与基质间相互作用及识别等生物学过程中具有重要的调控作用,导致许多疾病的发生发展过程均涉及了蛋白的异常糖基化。我们前期应用二维电泳及质谱技术已鉴定出22种高甘露糖型和23种唾液酸型差异表达的N-连接糖蛋白,本实验进一步验证了其中的7种蛋白质分子在ESCC组织及血清中的表达规律及临床意义。目的本研究应用Western blot技术验证前期鉴定的7种蛋白在ESCC不同临床分期组织及血清中的表达规律,探讨这些蛋白质分子诊断ESCC的临床应用价值及前景,为鉴定ESCC特异敏感的生物标志物提供实验依据;此外,分析这些蛋白的表达异常与ESCC发生、发展及演进过程的关系,更深入地理解ESCC发生发展的分子机制。材料与方法1 ESCC及癌旁组织:选取标本库中年龄、性别匹配的TNM I-IV期(各期20例)ESCC及其癌旁组织标本,用IP裂解液裂解提取组织蛋白,Bradford法测组织蛋白浓度;2血清标本:选取ESCC血清72例、食管炎血清48例和上消化道不适但食管黏膜组织学正常血清24例。血清N-连接糖蛋白富集采用三种混合植物凝集素包括刀豆蛋白凝集素(Concanavalin A,Con A)、晶状体凝集素(Lentil lectin,LCH)及雪花凝集素(Snowdrop lectin,GNA)组成的亲和层析柱富集纯化。3 Western blot:应用12%分离胶、4%浓缩胶电泳分离蛋白、转膜、牛奶封闭,孵育一抗、二抗,ECL显色曝光。4半定量分析:采用Image Master软件对Western blot条带进行扫描和灰度分析。5统计学分析:采用SPSS17.0统计软件处理,Western blot灰度分析结果采用t检验,P<0.05具有统计学意义。结果1本研究验证了7种候选糖蛋白标志物在ESCC中的差异表达。触珠蛋白(Haptoglobin,HP)在ESCC的Ⅰ-Ⅲ期的癌组织中表达明显低于正常组织(P<0.05),HP在TNMⅠ期中表达最低,HP低表达与临床TNM分期呈负相关(P<0.05);2在TNMⅢ和Ⅳ期ESCC中组织蛋白酶原D(Procathepsin D,p CD)表达显著高于癌旁组织学正常黏膜组织(P<0.05),在TNMⅠ和Ⅱ期中亦升高但无统计学意义;3在TNMⅠ期ESCC组织中超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05),但TNMⅡ和Ⅲ期中具有升高趋势;4 ESCC及癌旁组织中C3(Complement C3,C3)、人脯氨酸/精氨酸丰富端亮氨酸丰富蛋白(PRELP)和凝集素(Clusterin,CLU)的表达变化无明显规律;5 ESCC血清中HP的表达明显高于食管黏膜炎症及食管黏膜组织学正常血清(P<0.05),而ESCC血清中Clusterin表达与HP相反,明显低于食管黏膜炎症及食管黏膜组织学正常血清(P<0.05);6对HP表达无明显变化的ESCC血清中,N-糖基化HP血清表达明显高于食管黏膜炎症组和组织学正常组(P<0.05)。结论1 HP表达异常可能参与了ESCC发生发展过程,血清HP或N-糖基化HP是潜在的ESCC血清标志物,但尚需进一步研究证实。2 p CD可能参与了中晚期ESCC浸润、转移等恶性演进过程。