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近年来的流行病学调查显示，世界糖尿病患者的总数将从2000年的1.71亿上升到2030年的3.66亿，去年500万人死于糖尿病，半数年龄低于60岁。我国糖尿病患者人数达1.14亿，“糖尿病已经在中国达到了流行病的程度”。国内外临床观察与动物实验资料均证明，冠状动脉血管病变及由此引起的缺血性心脏病是2型糖尿病的主要并发症和死亡原因之一。研究还证明糖尿病患者缺血性心脏病其心肌细胞死亡数量及心功能损伤程度均远远高于其它缺血性心脏病患者，心肌梗死后并发症和死亡率升高2-3倍。这些结果强烈提示，虽然致力于阐明糖尿病血管病变的发病机理对于降低糖尿病缺血性心脏病的发病率至关重要，然而为达到降低糖尿病缺血性心脏病死亡率的最终目标，深入阐明糖尿病导致心肌细胞对缺血性刺激易损性增加的细胞内信号转导机制具有同等重要的意义。
胰高血糖样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种主要由远端回肠、直肠和结肠的L细胞分泌的多肽激素，进食活动促进其分泌，并通过刺激胰岛素的生成来维持血糖稳态，该现象被成为“肠促胰岛素效应”。目前研究已证实，GLP-1在改善血糖控制的同时，具有确切心血管保护作用。不仅扩张动脉、影响内皮和心功能、改善心肌收缩力，在心脏缺血损伤中外源性GLP-1减轻心肌细胞凋亡，GLP-1受体敲除则加重心肌损伤，提示GLP-1信号活性是降低冠脉损伤和心肌缺血的重要原因。课题预实验证实，糖尿病鼠心脏缺血再灌注后血浆GLP-1水平升高，与心肌损伤程度变化趋势一致，高水平GLP-1反而未表现心肌保护作用，提示GLP-1功能敏感性受损，由此推测心肌GLP-1功能敏感性改变可能与糖尿病心肌易损性增加有关。
本课题从GLP-1、GLP-1受体、GLP-1受体后通路三方面阐述验证糖尿病心脏缺血再灌注后心肌易损性增加的发生机制，我们在本研究中提出如下问题：(1)外源性GLP-1治疗糖尿病心脏缺血再灌注损伤的保护作用是否受损？(2)糖尿病心脏缺血再灌注后，循环血液中GLP-1水平变化如何？心肌细胞GLP-1R水平变化如何？影响GLP-1R变化的因素是什么？(3)糖尿病心脏缺血再灌注后，心肌细胞GLP-1R后信号通路如何变化？
【目的】
1.明确外源性GLP-1的保护心肌功能在糖尿病鼠心肌缺血再灌注模型中是否受损。
2.从循环GLP-1含量、细胞GLP-1R表达量及GLP-1R后信号通路三个方面探寻糖尿病鼠心肌缺血再灌注后易损性增加的新机制。
【研究方法】
1.外源性GLP-1R激动剂对糖尿病鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用减低
1.1以db/db鼠为自发2型糖尿病鼠模型，C57BLKS/J鼠为对照。
心肌缺血再灌注模型通过结扎鼠心脏冠脉左前降支30分钟后再灌注实现，术中实时监测心电图以保证模型成功。外源性GLP-1通过腹腔注射给予，自术前1小时开始，1.0nmol/kg/天。
1.2实验分组：A组(C57鼠+假手术)；B组(C57鼠+缺血再灌注)；C组(C57鼠+缺血再灌注+Exendin-4预处理)；D组(db/db鼠+假手术)；E组(db/db鼠+缺血再灌注)；F组(db/db鼠+缺血再灌注+Exendin-4预处理)
1.3小动物超声检测心功能变化
1.4蛋白免疫印迹及qRT-PCR检测凋亡及氧化应激
1.5分光光度法检测caspase-3活性
1.6术后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时分别经鼠尾取血，ELISA检测循环中GLP-1含量变化
2.PKCβ参与调节糖尿病鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R下降
2.1H9C2心肌细胞siRNA转染(PKCαsiRNA、PKCβsiRNA、PKCλsiRNA、PKCδsiRNA、scramblesiRNA)
2.2实验分组：a组：5.5mmol/L葡萄糖；b组：33mmol/L葡萄糖；c组：33mmol/L葡萄糖+PMA；d组：33mmol/L葡萄糖+Go6983；e组：33mmol/L葡萄糖+PMA+Go6983；f组：33mmol/L葡萄糖+PKCαsiRNA；g组：33mmol/L葡萄糖+PKCαsiRNA+PMA；h组：33mmol/L葡萄糖+PKCβsiRNA；i组：33mmol/L葡萄糖+PKCβsiRNA+PMA；j组：33mmol/L葡萄糖+PKCλsiRNA；k组：33mmol/L葡萄糖+PKCλsiRNA+PMA；l组：33mmol/L葡萄糖+PKCδsiRNA；m组：33mmol/L葡萄糖+PKCδsiRNA+PMA；n组：33mmol/L葡萄糖+ScramblesiRNA；o组：33mmol/L葡萄糖+ScramblesiRNA+PMA
2.2H9C2心肌细胞缺氧复氧模型：
通过三气培养箱建立缺氧复氧模型，缺氧95%N25%CO230分钟，复氧95%ambientair5%CO2。
2.3免疫蛋白印迹检测GLP-1R表达变化
2.4qRT-PCR检测GLP-1RmRNA表达变化
3.PKCδ损害PI3K-Akt通路是糖尿病心肌易损性增加的机制
3.1H9C2心肌细胞siRNA转染如方法2.1所述。
3.2实验分组：Ⅰ.5.5mmol/L葡萄糖；Ⅱ.33mmol/L葡萄糖；Ⅲ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧；Ⅳ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+Ex-4；Ⅴ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCβsiRNA+Ex-4；Ⅵ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCαsiRNA+Ex-4；Ⅶ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCλsiRNA+Ex-4；Ⅷ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCδsiRNA+Ex-4;Ⅸ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+scramblesiRNA+Ex-4；Ⅹ33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+Ex-4+Wortmannin；Ⅺ33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCδsiRNA+Ex-4+PMA;Ⅻ33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+Ex-4+IGF-1
3.3免疫的蛋白印迹检测PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2、PKCδ变化
3.4分光光度法检测caspase-3活性
【研究结果】
1.糖尿病鼠心肌缺血再灌注后GLP-1敏感性下降
1.1与C57非糖尿病鼠缺血再灌注后心功能相比，db/db糖尿病鼠在缺血再灌注后心功能受损更严重，表现为射血分数下降；外源性GLP-1R激动剂的给予能有效逆转C57非糖尿病鼠缺血再灌注导致的心功能下降，可是在db/db糖尿病鼠，外源性GLP-1R激动剂的逆转心功能的效应大幅减低。
1.2缺血再灌注加重C57非糖尿病鼠和db/db糖尿病鼠心肌细胞的氧化应激，氧化应激效应分子NOX4，p22phox在db/db糖尿病鼠缺血再灌注损伤后表达高于C57非糖尿病鼠缺血再灌注后；外源性GLP-1R激动剂能有效减轻C57非糖尿病鼠心肌细胞缺血再灌注后的氧化应激水平，却对db/db糖尿病鼠缺血再灌注损伤后的心肌细胞作用不显著。
1.3缺血再灌注加重C57非糖尿病鼠和db/db糖尿病鼠心肌细胞的凋亡反应，表现在Bcl-2分子下调，caspase-3活性上升；外源性GLP-1R激动剂能有效减轻C57非糖尿病鼠缺血再灌注后心肌细胞的凋亡反应，而对db/db糖尿病鼠缺血再灌注损伤后的心肌细胞的凋亡反应影响不显著。
1.4糖尿病鼠心肌缺血再灌注后，循环血中GLP-1浓度上升。
2.PKCβ参与下调高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达
2.1动物实验证实在db/db糖尿病鼠心肌细胞GLP-1R表达低于C57非糖尿病鼠。经历缺血再灌注后，db/db糖尿病鼠心肌细胞GLP-1R表达略微上调，但仍低于C57非糖尿病鼠。细胞实验得到相应的结果。
2.2在细胞实验中，利用PKC抑制剂证实，抑制高糖培养的心肌细胞PKC活性使GLP-1R表达回升，而这一效应能被PKC激动剂阻断。提示PKC参与了高糖培养的心肌细胞GLP-1R的表达下调。
2.3利用siRNA转染下调PKC各亚型，发现PKCβ的表达下调使高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达上升，而相对应的，PKCα、PKCλ和PKCδ的表达下调对高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达几无影响。
3.PKCδ通过抑制PI3K-Akt通路介导高糖培养的心肌细胞GLP-1敏感性下降
3.1下调PKCβ后，外源性GLP-1R激动剂在高糖培养的心肌细胞抗氧化应激作用增强，提示GLP-1R上调发挥效用。
3.2下调PKCβ虽然使高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达上调，但在施加外源性GLP-1R激动剂后，其抗凋亡效应并未加强，提示受体后抗凋亡信号通路受损。
3.3下调PKCδ使高糖培养的心肌细胞在外源性GLP-1R激动剂作用下抗凋亡效应加强，而相对应的，下调PKCα、PKCβ和PKCλ影响甚微。提示PKCδ参与高糖培养的心肌细胞GLP-1敏感性下降。
3.4下调PKCδ使磷酸化Akt及bcl-2水平升高，caspase-3活性下降，而对PI3K无影响，同时，抑制PI3K对PKCδ无影响，提示PKCδ通过抑制Akt磷酸化进程破坏PI3K-Akt通路及其抗凋亡效应。
【研究结论】
1.本课题证实了糖尿病/高血糖状态下鼠心肌细胞对GLP-1的敏感性下降，表现为外源性GLP-1R激动剂的保护心肌功能受损。
2.本课题研究了高血糖培养的心肌细胞GLP-1敏感性下降的原因，其一是在高糖培养的心肌细胞里GLP-1R下降，通过进一步的实验我们发现PKCβ参与介导GLP-1R表达的下调；其二是在高糖培养的心肌细胞中，GLP-1R后信号通路受损，PKCδ通过抑制Akt磷酸化阻碍PI3K-Akt通路致使GLP-1R后抗凋亡信号通路的损坏。
胰高血糖样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种主要由远端回肠、直肠和结肠的L细胞分泌的多肽激素，进食活动促进其分泌，并通过刺激胰岛素的生成来维持血糖稳态，该现象被成为“肠促胰岛素效应”。目前研究已证实，GLP-1在改善血糖控制的同时，具有确切心血管保护作用。不仅扩张动脉、影响内皮和心功能、改善心肌收缩力，在心脏缺血损伤中外源性GLP-1减轻心肌细胞凋亡，GLP-1受体敲除则加重心肌损伤，提示GLP-1信号活性是降低冠脉损伤和心肌缺血的重要原因。课题预实验证实，糖尿病鼠心脏缺血再灌注后血浆GLP-1水平升高，与心肌损伤程度变化趋势一致，高水平GLP-1反而未表现心肌保护作用，提示GLP-1功能敏感性受损，由此推测心肌GLP-1功能敏感性改变可能与糖尿病心肌易损性增加有关。
本课题从GLP-1、GLP-1受体、GLP-1受体后通路三方面阐述验证糖尿病心脏缺血再灌注后心肌易损性增加的发生机制，我们在本研究中提出如下问题：(1)外源性GLP-1治疗糖尿病心脏缺血再灌注损伤的保护作用是否受损？(2)糖尿病心脏缺血再灌注后，循环血液中GLP-1水平变化如何？心肌细胞GLP-1R水平变化如何？影响GLP-1R变化的因素是什么？(3)糖尿病心脏缺血再灌注后，心肌细胞GLP-1R后信号通路如何变化？
【目的】
1.明确外源性GLP-1的保护心肌功能在糖尿病鼠心肌缺血再灌注模型中是否受损。
2.从循环GLP-1含量、细胞GLP-1R表达量及GLP-1R后信号通路三个方面探寻糖尿病鼠心肌缺血再灌注后易损性增加的新机制。
【研究方法】
1.外源性GLP-1R激动剂对糖尿病鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用减低
1.1以db/db鼠为自发2型糖尿病鼠模型，C57BLKS/J鼠为对照。
心肌缺血再灌注模型通过结扎鼠心脏冠脉左前降支30分钟后再灌注实现，术中实时监测心电图以保证模型成功。外源性GLP-1通过腹腔注射给予，自术前1小时开始，1.0nmol/kg/天。
1.2实验分组：A组(C57鼠+假手术)；B组(C57鼠+缺血再灌注)；C组(C57鼠+缺血再灌注+Exendin-4预处理)；D组(db/db鼠+假手术)；E组(db/db鼠+缺血再灌注)；F组(db/db鼠+缺血再灌注+Exendin-4预处理)
1.3小动物超声检测心功能变化
1.4蛋白免疫印迹及qRT-PCR检测凋亡及氧化应激
1.5分光光度法检测caspase-3活性
1.6术后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时分别经鼠尾取血，ELISA检测循环中GLP-1含量变化
2.PKCβ参与调节糖尿病鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R下降
2.1H9C2心肌细胞siRNA转染(PKCαsiRNA、PKCβsiRNA、PKCλsiRNA、PKCδsiRNA、scramblesiRNA)
2.2实验分组：a组：5.5mmol/L葡萄糖；b组：33mmol/L葡萄糖；c组：33mmol/L葡萄糖+PMA；d组：33mmol/L葡萄糖+Go6983；e组：33mmol/L葡萄糖+PMA+Go6983；f组：33mmol/L葡萄糖+PKCαsiRNA；g组：33mmol/L葡萄糖+PKCαsiRNA+PMA；h组：33mmol/L葡萄糖+PKCβsiRNA；i组：33mmol/L葡萄糖+PKCβsiRNA+PMA；j组：33mmol/L葡萄糖+PKCλsiRNA；k组：33mmol/L葡萄糖+PKCλsiRNA+PMA；l组：33mmol/L葡萄糖+PKCδsiRNA；m组：33mmol/L葡萄糖+PKCδsiRNA+PMA；n组：33mmol/L葡萄糖+ScramblesiRNA；o组：33mmol/L葡萄糖+ScramblesiRNA+PMA
2.2H9C2心肌细胞缺氧复氧模型：
通过三气培养箱建立缺氧复氧模型，缺氧95%N25%CO230分钟，复氧95%ambientair5%CO2。
2.3免疫蛋白印迹检测GLP-1R表达变化
2.4qRT-PCR检测GLP-1RmRNA表达变化
3.PKCδ损害PI3K-Akt通路是糖尿病心肌易损性增加的机制
3.1H9C2心肌细胞siRNA转染如方法2.1所述。
3.2实验分组：Ⅰ.5.5mmol/L葡萄糖；Ⅱ.33mmol/L葡萄糖；Ⅲ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧；Ⅳ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+Ex-4；Ⅴ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCβsiRNA+Ex-4；Ⅵ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCαsiRNA+Ex-4；Ⅶ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCλsiRNA+Ex-4；Ⅷ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCδsiRNA+Ex-4;Ⅸ.33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+scramblesiRNA+Ex-4；Ⅹ33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+Ex-4+Wortmannin；Ⅺ33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+PKCδsiRNA+Ex-4+PMA;Ⅻ33mmol/L葡萄糖+缺氧复氧+Ex-4+IGF-1
3.3免疫的蛋白印迹检测PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2、PKCδ变化
3.4分光光度法检测caspase-3活性
【研究结果】
1.糖尿病鼠心肌缺血再灌注后GLP-1敏感性下降
1.1与C57非糖尿病鼠缺血再灌注后心功能相比，db/db糖尿病鼠在缺血再灌注后心功能受损更严重，表现为射血分数下降；外源性GLP-1R激动剂的给予能有效逆转C57非糖尿病鼠缺血再灌注导致的心功能下降，可是在db/db糖尿病鼠，外源性GLP-1R激动剂的逆转心功能的效应大幅减低。
1.2缺血再灌注加重C57非糖尿病鼠和db/db糖尿病鼠心肌细胞的氧化应激，氧化应激效应分子NOX4，p22phox在db/db糖尿病鼠缺血再灌注损伤后表达高于C57非糖尿病鼠缺血再灌注后；外源性GLP-1R激动剂能有效减轻C57非糖尿病鼠心肌细胞缺血再灌注后的氧化应激水平，却对db/db糖尿病鼠缺血再灌注损伤后的心肌细胞作用不显著。
1.3缺血再灌注加重C57非糖尿病鼠和db/db糖尿病鼠心肌细胞的凋亡反应，表现在Bcl-2分子下调，caspase-3活性上升；外源性GLP-1R激动剂能有效减轻C57非糖尿病鼠缺血再灌注后心肌细胞的凋亡反应，而对db/db糖尿病鼠缺血再灌注损伤后的心肌细胞的凋亡反应影响不显著。
1.4糖尿病鼠心肌缺血再灌注后，循环血中GLP-1浓度上升。
2.PKCβ参与下调高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达
2.1动物实验证实在db/db糖尿病鼠心肌细胞GLP-1R表达低于C57非糖尿病鼠。经历缺血再灌注后，db/db糖尿病鼠心肌细胞GLP-1R表达略微上调，但仍低于C57非糖尿病鼠。细胞实验得到相应的结果。
2.2在细胞实验中，利用PKC抑制剂证实，抑制高糖培养的心肌细胞PKC活性使GLP-1R表达回升，而这一效应能被PKC激动剂阻断。提示PKC参与了高糖培养的心肌细胞GLP-1R的表达下调。
2.3利用siRNA转染下调PKC各亚型，发现PKCβ的表达下调使高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达上升，而相对应的，PKCα、PKCλ和PKCδ的表达下调对高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达几无影响。
3.PKCδ通过抑制PI3K-Akt通路介导高糖培养的心肌细胞GLP-1敏感性下降
3.1下调PKCβ后，外源性GLP-1R激动剂在高糖培养的心肌细胞抗氧化应激作用增强，提示GLP-1R上调发挥效用。
3.2下调PKCβ虽然使高糖培养的心肌细胞GLP-1R表达上调，但在施加外源性GLP-1R激动剂后，其抗凋亡效应并未加强，提示受体后抗凋亡信号通路受损。
3.3下调PKCδ使高糖培养的心肌细胞在外源性GLP-1R激动剂作用下抗凋亡效应加强，而相对应的，下调PKCα、PKCβ和PKCλ影响甚微。提示PKCδ参与高糖培养的心肌细胞GLP-1敏感性下降。
3.4下调PKCδ使磷酸化Akt及bcl-2水平升高，caspase-3活性下降，而对PI3K无影响，同时，抑制PI3K对PKCδ无影响，提示PKCδ通过抑制Akt磷酸化进程破坏PI3K-Akt通路及其抗凋亡效应。
【研究结论】
1.本课题证实了糖尿病/高血糖状态下鼠心肌细胞对GLP-1的敏感性下降，表现为外源性GLP-1R激动剂的保护心肌功能受损。
2.本课题研究了高血糖培养的心肌细胞GLP-1敏感性下降的原因，其一是在高糖培养的心肌细胞里GLP-1R下降，通过进一步的实验我们发现PKCβ参与介导GLP-1R表达的下调；其二是在高糖培养的心肌细胞中，GLP-1R后信号通路受损，PKCδ通过抑制Akt磷酸化阻碍PI3K-Akt通路致使GLP-1R后抗凋亡信号通路的损坏。