苯巴比妥（Phenobarbital）作为催眠、镇静、抗惊厥、抗癫痫的医用药物,在临床上常用于治疗精神焦虑、失眠、癫痫、高胆红素血症等。由于苯巴比妥的镇静催眠效果较好,若添加在动物饲料中,可以提高牲畜体重,增加经济效益。但苯巴比妥对人体具有致畸、致癌等不良影响,因此各国均严禁食品动物生产养殖过程中出现苯巴比妥,食品动物和动物性食品中均不得检出。在药物残留检测领域,免疫学分析因其高效特异性、灵敏性及快速简便等优点而得以广泛应用。欧美等发达国家均已研制出快速检测苯巴比妥残留的免疫学检测产品,而国内研究鲜见报导,更未见商业化试剂盒应用。本研究首先分析苯巴比妥的分子结构,在此基础上制备相应的抗原和单克隆抗体,并研出发苯巴比妥荧光定量检测试纸条,最后对试纸条性能进行测试。主要研究成果如下:（1）苯巴比妥人工抗原的合成与鉴定:以苯巴比妥钠为起始原料,经取代、水解两步化学反应制备包被半抗原AA苯巴比妥和免疫半抗原CA苯巴比妥,合成的半抗原均通过质谱鉴定。包被半抗原CA苯巴比妥和免疫半抗原AA苯巴比妥通过活泼酯法活化后与BSA或OVA偶联制备了免疫原CA苯巴比妥-BSA和包被原AA苯巴比妥-OVA。经紫外扫描法鉴定,免疫原CA苯巴比妥-BSA和包被原AA苯巴比妥-OVA分别在270nm和276nm处出现峰值,表明苯巴比妥人工抗原成功合成。（2）抗苯巴比妥单克隆抗体的制备与鉴定以人工合成的免疫原CA苯巴比妥-BSA和包被原AA苯巴比妥-OVA免疫6-8周龄雌性BALB/C小鼠,在四免后利用间接ELISA选择细胞融合备用小鼠1只,利用细胞融合技术筛选7H2、17A3、22H4、25C7、29B2和43E86株阳性细胞株,其中29B2细胞株分泌的抗体性能最佳。利用动物体内诱生腹水法对10-12周龄雌性BALB/C小鼠接种1×10~6-10~7CFU/m L个杂交瘤细胞制备苯巴比妥单克隆抗体。腹水经亲和柱法或辛酸-硫酸铵沉淀法纯化,通过方阵滴定法确定最佳使用浓度:酶标二抗的使用浓度为2000倍稀释,包被原AA苯巴比妥-OVA最佳包被浓度为0.25μg/m L,抗体的最佳使用浓度为0.125μg/m L;在此抗原浓度下,抗体效价为1:640000。以间接ELISA对苯巴比妥标准品进行四参数Logistic曲线拟合绘制标准曲线,经计算得出苯巴比妥IC50值为24.90μg/L,在5～405μg/L呈线性关系;与结构类似物巴比妥、戊巴比妥和异戊巴比妥的交叉反应率均小于0.3%,表明该单克隆抗体对其他三种巴比妥类药物均无交叉反应,特异性良好。（3）荧光定量检测试纸条的开发利用单克隆抗体偶联默克公司F1XC030型号羧基荧光纳米微球进行苯巴比妥荧光定量检测试纸条研制。最终确定偶联体系的最佳碱用量为80μL（0.1M碳酸钾溶液）;单克隆抗体偶联荧光纳米微球的最佳使用量为0.25mg（0.5m L荧光微球标记抗体）;NC膜的最佳烘干时间为16h;样品垫处理液最佳体系为含2.0%蔗糖、0.05%吐温20、1%BSA的0.1M苯巴比妥S（p H=7.4）缓冲液;质控区C线的兔Ig G的最佳包被浓度为0.25mg/m L,羊抗兔Ig G偶联荧光纳米微球后的最佳稀释倍数为500倍;检测区T线的包被抗原AA苯巴比妥-OVA最佳包被浓度为0.5mg/m L,偶联抗苯巴比妥单克隆抗体后荧光纳米微球的最佳稀释倍数为200倍。经测试,苯巴比妥荧光定量检测试纸条对苯巴比妥标准品的检测灵敏度为20μg/L:当苯巴比妥的标准品含量为20μg/L时,其T/C数值为不含标准品T/C值的77.32%,表明试剂卡在此标准品浓度下检测的T/C值与0.01M苯巴比妥S测试卡的T/C值有明显差异。同时对水产类（罗非、叉尾、草鱼、鲈鱼、鲢鱼）和植物类保健食品类（鱼腥草、三七、葛根、山楂、金银花）等两大类的样本类型进行标品添加回收测定。水产类样本的添加回收结果相对较稳定,回收率范围在82%-130%,但叉尾的回收率波动相对较大,回收范围为68%-127%;植物保健食品类的添加回收率要比水产类组织的波动要大,回收率范围在60%-137%。样本检测限为50μg/L时,假阴性率、假阳性率均为0%;与巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥的交叉反应率均小于0.3%;试纸条的板内和板间变异系数均小于8%;研制的苯巴比妥荧光定量检测试纸条在45℃下密封保存60天性能不变;偶联有抗苯巴比妥单克隆抗体和羊抗兔的荧光纳米微球工作浓度的荧光液在37℃下避光保存14天性能不变。本研究所建立的苯巴比妥荧光定量检测试纸条与ELISA和胶体金方法相比,检测时间从75min缩短为10min,在保持同样高灵敏度的前提下,实现了微量定量检测。本研究制备的苯巴比妥荧光定量试纸条可满足实际快筛市场的需求,也为实现商品化荧光定量检测试纸条的组装提供了参考。