论文部分内容阅读
病毒离子孔道蛋白(Viroporins)是由病毒编码的一类小分子量、疏水性跨膜蛋白。它们一般由50-120个氨基酸残基组成,至少有一个疏水性跨膜结构域。这些疏水性跨膜区能够与宿主细胞内的磷脂双分子层相互作用并使磷脂双分子层扩散。离子孔道蛋白参与破坏宿主细胞的形态并扰乱宿主细胞的生理学功能以保证病毒能够完成其完整的生命周期。小RNA病毒科肠道病毒属病毒编码的2B蛋白具有寡聚化形成跨膜孔道、增加宿主细胞膜通透性、扰乱宿主细胞Ca2+体内平衡、诱导宿主细胞发生自噬以及诱导宿主细胞的凋亡等viroporin特性。本研究中,以小RNA病毒科肠道病毒属中的脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒的2B蛋白研究为参考,借鉴多种病毒离子孔道蛋白的研究方法,对口蹄疫病毒非结构蛋白2B的结构特性和功能展开初步研究。1.运用在线预测软件对2B蛋白氨基酸序列进行预测,结果显示,亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒2B基因含有462 bp,总共编码154个氨基酸。整条肽链拥有两个疏水区,分别为氨基酸83-104和氨基酸119-137。构建pXJ-FLAG-2B, pXJ-2B-HA及pXJ-2BΔ(110-111)等带有不同标签的重组质粒在BHK-21细胞中表达,并采用0.01% TritonX-100和洋地黄皂苷(0.01mg/mL)对细胞的处理,确定了2B蛋白的跨膜方式与ⅡA型viroporin的跨膜方式一致。构建带有绿色荧光标签的重组质粒pEGFPNl-2B在BHK-21细胞中表达,并采用激光共聚焦显微镜的观察,确定了2B蛋白定位于内质网。构建带有SUMO标签的重组质粒pSMK-2B在大肠杆菌C43(DE3)中表达并纯化,经戊二醛作用,2B蛋白单体之间出现了不同程度的寡聚化作用,确定了2B蛋白在细胞外能够相互作用；同时,免疫共沉淀实验显示,带有不同标签的2B蛋白单体间出现寡聚化作用,确定了2B蛋白在BHK-21细胞内也能够相互作用。2B蛋白的这些结构特性与viroporin的一般结构特性相一致。2.通过对比空载体质粒pSMK以及重组质粒pSMK-2B在大肠杆菌BL21(DE3)和C43(DE3)的表达以及两种重组菌株的增殖情况。结果显示,2B蛋白只在毒性耐受性更强的大肠杆菌C43(DE3)菌株中表达,而且与大肠杆菌C43(DE3)相比,大肠杆菌BL21(DE3)的增殖明显受到抑制。这证明了2B蛋白对原核细胞有一定的毒性作用。将重组质粒pXJ-FLAG-2B或pXJ-2B-HA转入BHK-21细胞,2B蛋白在BHK-21细胞中表达后,破坏了细胞膜结构的完整性,并引起了细胞内Ca2+浓度的显著升高。同时,2B蛋白在BHK-21细胞以及H1299细胞中的表达,也显著地引起细胞内LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ的分割以及LC3在细胞内的集聚。也就是说,2B蛋白在BHK-21细胞及H1299细胞中的表达诱发了细胞发生较高水平的自噬。综上所述,口蹄疫病毒编码的非结构蛋白2B具有与viroponn相类似的结构特性,并能够发挥与viroponn相类似的生理功能。这些结果表明,口蹄疫病毒的2B蛋白可能属于viroponn成员。