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目的:已有报道高浓度的成纤维生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)是心房颤动的预测因子,但是并无研究报道FGF23引起心房颤动(Atrial fibrillation,AF)的机制,本研究主要目的是探讨FGF23诱导AF患者心房纤维化的机制。方法:1.经过南昌大学第二附属医院论理委员会批准,向在南昌大学第二附属医院心脏外科接受心脏二尖瓣置换手术的风湿性瓣膜病患者取心房组织,所有患者均与本人及其家属签署知情同意书。根据患者是否合并房颤分为AF组(20例)和窦性心律组(SR,20例)。手术过程中小心切除心房组织,使用生理盐水小心冲洗干净,然后用4%甲醛溶液固定。1.1苏木精-伊红(HE)染色和Masson的三色染色取组织切片固定后行HE和Masson染色,采用计算机图像分析系统进行胶原半定量分析。视野中胶原为组织的含量在片子上以蓝色的作为标记。最后取其均值作为胶原容积。1.2免疫组化将石蜡包埋的人心脏组织切成4μm切片。使用FGF23、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和FGFR4的抗体(Abcam)进行免疫组织化学染色。通过阳性染色面积/总面积指示的Image-Pro Plus 6.0确定免疫阳性面积的定量。2.原代心脏成纤维细胞(CFs)的培养快速清洗心房组织,尽量剪成1mm大小,然后加入胰蛋白酶?,消化完成后,通过差速离心收集成纤维细胞。用不同浓度(0,12.5,25或50ng/ml)的重组FGF23蛋白?(26.1±kDa;R&D Systems)培养CF.(R&d,加利福尼亚州,美国)然后,在不存在或存在25ng/ml重组FGF23蛋白的情况下,将CF与10mMn活性氧(ROS)抑制剂(NAC),?2.5μM信号转导和转录激活因子3(STAT3)抑制剂(Stattic)或?1Μm SMAD3抑制剂(SIS3)一起孵育48H。2.1流式细胞术测ROS收集CF并将密度调节至10 6个?细胞/ml。接下来,?添加10μMCMH2DCFDA并孵育60分钟,然后用PBS洗涤三次。最后,使用流式细胞术检测CF以量化ROS产生。2.2 Western blot(WB)和Real time PCR检测通路蛋白的改变2.2.1使用FGF23处理CFsa.通过Western Blot检测Collagen1以及a-sma的变化b.检测通路蛋白p-stat3、p-smad3和mmp2水平2.2.2使用stattic(stat3抑制剂)处理CFsa.通过Western Blot检测Collagen1以及a-sma的变化b.检测通路蛋白检测通路蛋白p-stat3、p-smad3和mmp2水平2.2.3使用SIS3(SMAD3抑制剂)处理CFsa.通过Western Blot检测Collagen1以及a-sma的变化b.检测通路蛋白检测通路蛋白p-stat3、p-smad3和mmp2水平2.2.4使用stattic和SIS3共同处理,观察其对抑制纤维化的协调作用a.通过Western Blot检测Collagen1以及a-sma的变化b.检测通路蛋白检测通路蛋白p-stat3、p-smad3和mmp2水平2.3共免疫沉淀实验将培养的心脏成纤维细胞细胞重悬于NP40裂解缓冲液(50mmol/L Tris,150mmol/L NaCl,1%Nonidet P-40,5mmol/L EDTA,完全蛋白酶抑制剂混合物,10mmol/L NaF,1 mmol/L原钒酸钠,25mmol/Lβ-甘油磷酸盐)。将裂解物在旋转轮上用IP级抗体包括Stat3,Smad3(Cell Signaling Technology),flag(Sigma-Aldrich)和c-myc(Abcam)的那些在4℃温育过夜。然后,将蛋白质A/G珠(Santa Cruz)加入到裂解物中,然后孵育2小时。将珠子离心,并通过SDS-PAGE分离蛋白质复合物并通过Western印迹分析检测。结果:(1)AF患者较SR患者纤维化更严重,且FGF23和FGFR4表达均升高;(2)暴露于高溶度的FGF23中会增加CF中纤维化标志物和ROS的水平;(3)FGF23通过激活STAT3和SMAD3信号传导促进心房纤维化;(4)使用ROS抑制剂(NAC),STAT3抑制剂(stattic)和SMAD3抑制剂(SIS3)分别处理CF细胞,可逆转高浓度FGF23引起的纤维化相关蛋白水平的变化。(5)FGF23促进了STAT3和SMAD3之间的彼此作用结论:FGF23通过影响STAT3和SMAD3之间的相互作用介导房颤患者的心房纤维化。