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为研制农药特异性基因工程抗体,本研究以有机磷杀虫剂三唑磷和对硫磷为目标分析物,采用一种新型水溶性免疫佐剂(快速佐剂)进行了三唑磷和对硫磷单克隆抗体(单抗)的制备。该免疫佐剂操作简便,无需乳化,与人工抗原混合后可直接对Balb/c小鼠进行小腿肌肉注射,免疫脾细胞制备方便,细胞融合后筛选得到有效细胞株的阳性率超过30%;间接竞争酶联免疫吸附法(ic-ELISA)筛选获得能够稳定分泌高亲合力、高特异性抗体的杂交瘤细胞株,快速制备了针对农药三唑磷和对硫磷的高亲合力单抗,灵敏度和特异性等方面与以往采用弗氏佐剂获得的单抗相当,对三唑磷的识别灵敏度(IC50)0.91 ng/mL,对对硫磷识别灵敏度(IC50)8.18ng/mL。以制备的杂交瘤细胞株为RNA来源,采用抗体亚型特异性的简并性引物,通过RT-PCR法扩增了抗对硫磷单抗的y1亚型重链可变区(VH)和κ亚型轻链可变区(VL)的基因序列,以及抗三唑磷单抗的γ1亚型VH和稀有的λ亚型VL基因序列,通过重叠延伸PCR法成功将相应的VH、VL核苷酸序列经连接肽(Gly4Ser)3串联,构建了 VH-VL连接方式的单链抗体(scFv)全长序列。将抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv的全长序列依次构建到大肠杆菌原核表达体系、杆状病毒-昆虫细胞表迗系统、毕赤酵母真核表达系统中进行可溶性表达,免疫印迹法鉴定蛋白表达,ic-ELISA法评价抗体活性。结果表明,抗三唑磷抗体和抗对硫磷抗体的VH和VL基因序列被成功扩增,在毕赤酵母表达体系中更经济有效地获得了高活性的抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv,抗体活性与亲本单抗相当,为进一步展开新型抗体的分子设计奠定了研究基础。在明确表达体系的基础上,研究了轻重链可变区取向(VH-VL、VL-VH)对抗三唑磷scFv、抗对硫磷scFv的生物活性和表达水平的影响。结果表明,轻重链可变区不同取向对抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv的亲合力和特异性没有明显影响,产物具备特异性识别相应靶标化合物的能力,对三唑磷的IC50在0.4～0.5 ng/mL,对对硫磷IC50在8.5～10.5ng/mL,抗体活性与亲本单抗相当;相较而言,抗三唑磷scFv和抗对硫磷scFv在VL-VH取向下,更容易获得较高水平的蛋白表迗,表达量均迗700mg/L左右。随后,尝试了两个抗三唑磷scFv的串联,设计了不同轻重链可变区取向和连接肽长度的抗三唑磷双价串联单链抗体,ic-ELISA法鉴定不同抗体的活性。结果表明,抗三唑磷双价串联单链抗体的抗体活性与连接肽长短[Gly4Ser、(Gly4Ser)3]、单价scFv的表达情况无关,与轻重链取向有关,轻链在N端的构建方式更易获得高识别能力的抗体蛋白,亲合力(IC50在0.8～0.9 ng/mL)和特异性与亲本单抗相当。在上述研究基础上,设计了不同连接方式的三唑磷-对硫磷双特异性串联单链抗体。ic-ELISA法鉴定结果表明,轻重链可变区取向同样是影响三唑磷及对硫磷双特异性串联单链抗体识别能力的重要因素。其中,以VLT-VHT-Gly4Ser-VLP-VHP的构建方式更容易获得高识别能力的抗体,但对三唑磷和对硫磷的灵敏度均下降了近7倍,同时交叉识别谱发生了改变。综上所述,在构建高亲合力单链抗体、双价串联单链抗体以及双特异性串联单链抗体时,应优先考虑轻链可变区在N端的构建方式;在设计双特异性串联单链抗体时,还需要考虑两个scFv可变区片段之间的相互干扰导致抗体活性下降和非特异性结合的问题。最后,利用Accelrys公司的Discovery studioTM,根据抗体的氨基酸序列进行同源模建,构建了抗三唑磷单链抗体和抗对硫磷单链抗体的三维模型。对抗体与农药小分子间的对接构象进行了模拟,确定了对接过程中抗体的主要氨基酸作用位点。同时,结合表面等离子共振技术(SPR)测定抗体与小分子互作反应,明确了抗体与靶分子间结合的动力学和亲合能力,为进一步提高抗体的亲合力以及稳定性奠定了坚实的基础。