【研究背景】在当今世界,癌症仍然以较高的发病率威胁着人们的身体健康,并且逐渐成为人类生命的第一杀手。癌症的致病因素可以大致归结为两大方面:即环境因素和遗传因素,我们课题组长期以来关注遗传因素对癌症发生发展的影响。尤其关注蛋白络氨酸磷酸酶非受体11型基因（Protein tyrosine phosphatase,non-receptor type11,PTPN11）即PTPN11基因的突变与癌症的发生关系。PTPN11基因是原癌基因,编码含有Src同源区2-的蛋白络氨酸磷酸酶2（即SHP2）蛋白,SHP2蛋白含有两个串联的SH2结构域（N-SH2和C-SH2）以及一个蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein tyrosine phosphatase,PTP）结构域即PTP结构域。在生理状态下,SHP2蛋白的构象自我抑制,几乎没有任何催化活性,而功能获得性（Gain-of-function,GOF）突变即激活突变或者功能缺失性（Loss-of-function,LOF）突变即失活突变的SHP2在结构上暴露PTP结构域,使其去磷酸化下游蛋白或作为信号接头蛋白而发挥作用,从而触发致癌信号级联传导反应。之前的大量研究表明,SHP2蛋白突变与多种疾病的发生有关。并且有研究证实,PTPN11激活突变对人类的横纹肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma,RMS）的发生有影响,但这其中的机制尚不清楚。为了探究相关的机制,我们课题组做了大量的前期研究,我们了解到,肉瘤的发生与间充质干细胞的恶性转化有关。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSC）是一种起源于中胚层的多能干细胞,它具有干细胞的所有共性,即自我更新和多向分化的能力,可向骨、软骨、脂肪、心肌、神经、肝脏、皮肤、肺泡等多胚层组织分化。随着研究和应用的深入,间充质干细胞恶性转化形成肿瘤的现象也越来越多的被报道,其中大多是MSC体外长期培养后发生恶性转化,形成纤维肉瘤、骨肉瘤或者神经胶质肉瘤等,并且其中的机制不明。为了探究这其中的机制,我们课题组进行了前期实验,由于我们了解到Ptpn11E76K/+突变之后的SHP2蛋白的磷酸酶活性较于其他突变类型较高,所以我们提取Ptpn11E76K/+突变的杂合子小鼠的骨髓间充质干细胞,在体外培养一定代数之后进行实验,发现Ptpn11E76K/+激活突变的间充质干细胞有了非锚定生长能力,并且将其皮下注射到小鼠体内,可以使小鼠成瘤,而野生的MSC则不具备这些能力。这表明间充质干细胞发生Ptpn11E76K/+激活突变后发生了转化,甚至转化为了肉瘤细胞,但这其中的机理机制我们尚不清楚。为了探究相关机制,我查阅文献发现,近年来,相分离作为一种与疾病发生发展相关的机制被越来越多地提及。大量的文献研究报道生物体内的相分离与癌症的发生有关。相分离原是指自然界存在的一个普遍的物理学现象,即在原本均一的介质中产生与周围环境不同相的另一相的现象。在生物体内,相分离主要表现为大分子的物质（包括核酸和蛋白质）在分子之间多价相互作用力的作用下,互相吸引而形成结构功能相关的小“集团”,从而将周围与反应无关的物质与“集团”内的物质分隔开来,以保证相应反应的高效进行。这就使我们在宏观看来,像是蛋白在细胞内形成了不同相的区域,而这种相主要包括液相、胶相和固相,因此,生物体内的相分离类型千差万别,但一般是起源于液相,而后经由胶相最终变为固相分离,形成无膜细胞器。这其中的分子机制大多是由于大分子物质（核酸和蛋白质）之间存在的多价相互作用使它们聚集在一起,在这些大分子物质中,广泛存在内部无序区域（Intrinsically disordered regions,IDRs）,这些区域作为短基序支架促进无膜细胞器的形成。与此同时,之前的一项研究表明:当间充质干细胞发生Ptpn11E76K/+激活突变后细胞内的SHP2蛋白会在细胞内形成可视的相分离。并且通过融合实验和FRAP实验可以证明这种相分离是液相-液相相分离（Liquid-Liquid phase separation,LLPS）。并且该研究发现,当SHP2蛋白发生突变之后,突变蛋白会募集大量野生型SHP2蛋白,从而发生液相-液相相分离。然而,这种由SHP2蛋白突变产生的相分离现象与由SHP2激活突变导致的间充质干细胞发生的自发恶性转化两者之间是否有关系,以及通过影响什么样的机制参与了间充质干细胞的恶性转化我们尚不清楚。本研究拟采用SHP2E76K激活突变的小鼠模型,使用SHP2蛋白特异性变构抑制剂SHP099和ET070,研究SHP2蛋白激活突变后产生的相分离现象与间充质干细胞的恶性转化是否有关。【研究方法】1.将育龄（6-8周龄）工具鼠Mx1-Cre与Ptpn11E76K-neo/+的C57BL/6J小鼠杂交,得到所需要的Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+小鼠,并在新生小鼠生长到4-6周时,通过每隔一天腹腔注射p I-p C（20μg/只）共3次诱导Cre酶的表达,使Ptpn11E76K在骨髓间充质干细胞中突变。2.取利用PCR技术鉴定后的Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+（Ptpn11激活突变）小鼠股骨和胫骨,分离密质骨与骨髓中的间充质干细胞,并进行体外传代培养。3.在培养3代后,通过免疫荧光实验观察Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+激活突变的间充质干细胞内SHP2蛋白相分离的差异以及加药（SHP099和ET070）后相分离的差异。并通过western blot技术检测Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+激活突变间充质干细胞以及相应加药组（SHP099和ET070）间充质干细胞中SHP2蛋白表达的差异。4.通过CCK8、平板克隆、软琼脂集落形成实验检测SHP2变构抑制剂SHP099和ET070对Mx1-cre;Ptpn11E76K/+和Mx1-cre;Ptpn11+/+间充质干细胞的恶性行为的影响。5.提取加药组与对照组细胞总蛋白通过western blot实验检测ERK/p-ERK,AMPK/p-AMPK,m TOR/p-m TOR等分子的表达水平。6.将加药组（SHP099）和对照组的Ptpn11+/+和Ptpn11E76K/+（Ptpn11激活突变）间充质干细胞和野生型间充质干细胞分别皮下注射到C57BL/6小鼠体内,观察小鼠成瘤情况。15天后可触及小鼠皮下出现瘤组织,之后立即处死小鼠解剖并取出相应瘤体,称重拍照并统计。【实验研究结果】1.得到Mx1-cre;Ptpn11E76K/+和Mx1-cre;Ptpn11+/+的C57BL/6J小鼠。2.分离出原代Mx1-cre;Ptpn11+/+和Mx1-cre;Ptpn11E76K/+激活突变型骨髓间充质干细胞。3.与Mx1-cre;Ptpn11E76K/+组相比,对照组Mx1-cre;Ptpn11+/+的SHP2蛋白几乎未观察到相分离现象,且Mx1-cre;Ptpn11E76K/+组SHP2蛋白凝聚成的冷凝物在加药（SHP099和ET070）之后明显减少。通过western blot检测各组SHP2蛋白表达水平无差异。4.与未用药物处理组相比,SHP099和ET070处理后骨髓间充质干细胞的增殖能力、单克隆形成能力、集落形成能力、非锚定生长能力明显下降,即抑制了Mx1-cre;Ptpn11E76K/+激活突变的骨髓间充质干细胞的恶性转化。5.western blot实验结果表明Ptpn11E76K/+间充质干细胞的p-ERK和p-m TOR分子表达在加药（SHP099和ET070）处理后明显减少,p-AMPK蛋白表达在加药（SHP099和ET070）处理后升高。6.小鼠成瘤实验结果显示,注射野生型间充质干细胞的C57小鼠不成瘤。注射加药（SHP099）处理组细胞的荷瘤小鼠所成瘤组织相较于注射激活突变组细胞的荷瘤小鼠所成瘤组织瘤体小,且差异有统计学意义。【结论】SHP2的相分离通过刺激AMPK-m TOR信号通路的表达参与了SHP2E76K激活突变的间充质干细胞的恶性转化。