论文部分内容阅读
近年,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染所致结核病(tuberculosis,TB)的发病率和死亡率一直高居不下。在全球,Mtb感染者几占总人口的三分之一,每年TB新发和死亡患者分别在900万和200万人左右。在中国,TB(主要是肺结核)现有患者约500万人(80%在农村),数量居世界第二位,其发病数与死亡数一直高居法定报告甲乙类传染病的首位。目前,传统卡介苗的预防效果己不甚理想,并且耐药Mtb感染正逐渐增多。然而,Mtb的具体致病机制仍不十分清楚,这为研发新型疫苗和更加敏感有效的抗TB药物造成了很大障碍。本研究立足于Mtb侵袭相关基因mcela,首先,探讨了该基因在Mtb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性,并对其全长和截短序列分别进行了克隆、原核表达及纯化。其次,设计、转录合成了两条mcela特异性小干扰RNAs(small interfering RNAs,siRNAs),并通过HEK 293-T细胞,对siRNAs的抑制活性与抑制效率进行了鉴定。在上述工作基础上,进一步通过小鼠巨噬细胞RAW 264.7和人结肠癌上皮细胞CT 26.CL25,进行了T-McelA蛋白的细胞刺激实验、mcela特异性siRNA的体外干扰实验以及重组E.coli(表达完整McelA蛋白)的体外侵袭实验,着重探讨了McelA蛋白介导细菌侵袭的作用机制。此外,本研究还通过对多种微生物16S rDNAs的序列比对与进化树分析,分别设计、合成了细菌通用及特异性引物,建立了实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)快速分类与检测方法。 一、毒力基因mcela在Mtb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性 Mtb属专性需氧细胞内寄生菌,感染后能在宿主体内以休眠状态长期潜伏生存,并在一定条件下复苏、大量增殖从而引发疾病。鉴于Mtb在低于25℃时停止生长,故低温条件下长时间存活的Mtb菌株可以作为一种非增殖状态的体外模型。本研究选取两种标准株(强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra)及八种临床分离株(非耐药四株,耐利福平或异烟肼各两株),分别以4℃保存3 m与37℃培养2 w～5 w为其潜伏生存和活性增殖状态。通过溶菌酶、蛋白酶K及1%SDS裂解Mtb,提取、纯化总RNA,并以不含RNase的DNase消化去除DNA。设计、合成mcela特异性引物,以看家基因16S rRNA为平行参照,通过RT-PCR分别检测上述样品mcela的表达。结果显示,处于非增殖期的十种Mtb菌株,mcela基因均未见表达;而处于活性增殖期的上述菌株,mcela基因均有稳定表达,且在不同菌株的表达水平相似。上述结果初步提示,mcela基因的表达可能与Mtb侵袭力或潜伏生存能力有关。 二、McelA蛋白介导细菌侵袭的作用机制 首先,进行了全长与截短mcela基因的克隆及原核表达。设计Exo-primer、In-orimer及In-primer2共三对引物,通过巢式PCR,分别扩增Mtb(H37Rv)全长与截短的mcela基因——mcela和T-mcela,并将其克隆至6xHis原核表达载体pROEX-HTb和热诱导表达载体pBV220,分别通过IPTG或42℃加热诱导目的基因