[背景]结直肠癌是世界范围内常见的恶性肿瘤,在我国结直肠癌居癌症致死因素的第四位。近十年来,结直肠癌在我国的发病率有逐年上升的趋势。尽管近年来手术方式和辅助治疗手段不断发展,结直肠癌患者的生存率仍旧不理想。侵袭与转移是影响患者治疗效果和导致患者死亡的主要原因。像其他恶性肿瘤一样,结直肠癌的发生发展是一个多步骤多因素参与的复杂过程,从最初的腺瘤息肉到晚期的肿瘤扩散转移,整个过程可以长达数年或数十年。由于结直肠癌的发生发展呈现出明显的阶段性特征,因此结直肠癌一直被视为各种恶性肿瘤中的“模式肿瘤”。结直肠癌的发生与细胞周期、凋亡、信号转导和侵袭转移等机制有着密切的关系,因此,筛选其发生、转移相关基因并阐明其相关分子机制,寻找理想的用于早期诊断或判断预后的结直肠癌肿瘤标志物,将对临床结直肠癌的诊断、预防、治疗具有重要意义。近年来关于PAK1和HIF-1α在肿瘤组织中的异常表达逐渐受到重视,其在多种肿瘤中均有异常表达,且与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关,对部分肿瘤的诊断分型及预后判断均有一定价值。但是,PAK1和HIF-1α在结直肠癌中高表达的分子生物学机制和临床价值尚未完全明确。PAK(p21-activated kinase p21活化激酶)属于丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在人类中它包含六个家族成员,即PAKl-6,PAK1是第一个被鉴定出来并且研究最多的PAK家族成员,PAK1基因定位于人类染色体11q13.5-q14区。PAK1在细胞形成、运动、生存和增殖调节过程中起重要作用；PAK1与细胞的分裂、凋亡、和基因的转录密切相关；在分子生物学层面,PAK1在细胞生命周期的调控中具有重要作用；在各种复杂和精确的基因调控下,PAK1具有依照特定的生理需求集合多种信号的能力。PAK1在人类癌症中调控的分子机制还有待进一步明确。结直肠癌细胞的生长是一个复杂的过程,涉及细胞的增殖、变异及细胞生命周期的调节。在结直肠癌中,KRas和BRaf基因的突变率分别为40%和10%。KRas和BRaf可激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)。MAPK和ERK的激活和高表达在结直肠癌的发展过程中起着重要的作用。KRas可分别激活PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶,一种癌基因,其突变和激活具有致癌作用)或AKT-独立通道(蛋白激酶B,是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,在细胞存活和凋亡中起重要作用),在30%上皮癌中PI3K发生突变,而在22%结直肠癌中KRas和PI3K均发生突变。PAK1在结直肠癌细胞发展的分子生物学过程中具有重要的作用。PAK1是KRas和BRaf的上游调节因子,PAK1可通过KRas和BRaf激活ERK、MAPK通路从而促进细胞的转变并激活AKT从而增强细胞的侵袭和生存能力。PAK1的表达随着结直肠癌的进展逐渐增高。下调PAK1的表达可减弱ERK和AKT的活性,引起细胞增殖、迁移、侵袭及活力的下降。同时抑制ERK和AKT可降低PAK1的表达进而减弱细胞的活力,而单独的抑制ERK或AKT通路将部分的抑制细胞的迁移、侵袭及存活能力,但对细胞的分裂增殖没有影响。由于KRas可经PI3K-依赖途径激活PAK1,而突变的KRas和PI3K在结肠癌中具有重要作用,因此PAK1可能作为一个汇聚点接收来自于KRas和PI3K的信号,从而由ERK和AKT的活化作用促进结肠癌的增殖和转移。综上可知,PAK1经ERK和AKT依赖途径刺激结肠癌细胞的增长和转移,这确立了PAK1在结直肠癌细胞信号转换过程中的中心位置并阐明了由PAK1调控结直肠癌细胞侵袭和转移的机制。HIF-1(hypoxia inducible factor-1缺氧诱导因子-1)是由a和β两个亚基组成的异二聚体转录因子,其表达和活性受到细胞内氧浓度的严密调控,O：主要通过α亚基调节HIF-1的活性。HIF-1α是在缺氧条件下普遍存在于人和哺乳动物细胞内的一种核转录因子,是肿瘤进展的始动因素,在肿瘤发生发展中起重要作用。在无新生血管生成的微小实体瘤阶段,HIF-1α通过调控糖酵解作用来增强机体对低氧的耐受并为肿瘤细胞供应能量；当肿瘤扩大致数毫米时,HIF-1α又可通过控制血管的生成来调节氧的运输能力并为肿瘤的增殖、侵袭和转移提供条件。HIF-1α可调控40余种基因的表达(如Snail、Slug、Twist、SIP-1等)并在维持肿瘤细胞的能量代谢、促进新生血管的形成、增强肿瘤细胞的侵袭和转移等方面起着重要作用。而HIF-1α在人类癌症中调控的分子机制还有待进一步明确。EMT (epithelia-mesenchymal transition)过程是指具有细胞间紧密连接和黏附能力的上皮细胞转变成具有活动能力并能在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。EMT是上皮细胞癌获得浸润转移能力的一个重要途径。涉及调控EMT的重要转录因了包括Twist,Snail,Slug,SIP-1等,它们在癌细胞中均能抑制E-cadherin(E-钙粘蛋白,一种重要的肿瘤细胞侵袭转移抑制剂)的表达引起E-cadherin的下调从而诱导EMT过程的形成。研究发现肿瘤内部中HIF-1α和EMT相关转录因子的表达是相互协同的,HIF-1α能直接或间接的调节和诱导EMT相关转录因子(Twist、Snail、Slug、SIP-1)的表达并能调节各个转录因子的相互作用进而促进EMT过程。HIF-1α和Twist均属于bHLH家族成员并广泛参与调控器官生长发育、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程。HRE(缺氧反应元件)已被证实在Twist邻近的启动子上,Yang等研究发现,HIF-1α能通过直接与HRE结合而上调Twist的表达并促进EMT的形成和肿瘤的浸润及转移。HIF-Iα可促进Snail及SIP1基因的过表达,并与EMT过程的发生和一系列细胞改变有着密切联系。HIF-1α在缺氧条件下可激活转录因子SIP1从而阻止PO1Ⅱ (RNA聚合酶-Ⅱ)与E-cadherin上的启动子衔接,导致E-cadherin的表达降低从而促进EMT。赖氨酰氧化酶和赖氨酰氧化酶2已经被证实是HIF-1α的调节靶区并能在低氧环境中调节Snail以诱导EMT过程的发生并促进肿瘤转移。HIF-1α可激活Slug并与MT4-MMP(人膜型基质金属蛋白酶4)邻近启动子上的E-box结合位点相互作用从而激活MT4-MMP的转录并诱导EMT的发生。综上可知,在肿瘤微环境中,HIF-1α的激活是肿瘤发生的一个关键因素,HIF-1α可调控多种基因参与肿瘤的生长、血管生成、上皮细胞向间质细胞转化以及转移,并协调这些基因参与人类恶性肿瘤的侵袭及转移。[目的]结合PAK1与HIF-1α促进癌细胞侵袭和转移的分子机制,我们推测PAK1和HIF-1α可能在结直肠癌的侵袭和转移中发挥重要作用。通过检索,目前尚无联合检测PAK1和HIF-1α在结直肠癌中表达的相关文献,因此我们分别在mRNA和蛋白层面联合检测结直肠癌中PAK1和HIF-1α的表达情况,研究PAK1和HIF-1α在结直肠癌侵袭和转移中的表达以及分析它们之间的关系。[方法]1、标本来源：收集南方医科大学附属顺德第一人民医院2011年3月到2011年10月间结直肠癌手术切除组织标本60例；男36例,女24例,年龄51-82岁(中位66岁)；结肠癌34例,直肠癌26例；组织学分级：高分化10例,中分化31例,低分化19例；Dukes分期：A期10例,B期19例,C期19例,D期12例。2、研究方法：结直肠癌以苏木精-伊红(HE)染色法为判定和入选标准。采用荧光原位杂交(FISH)和免疫组化方法(IHC)分别检测60例结直肠癌患者的正常结直肠粘膜和结直肠癌组织中PAK1和HIF-1α表达的变化；采用FISH结果分析PAK1和HIF-1α在结直肠癌中表达的变化与结直肠癌的临床病理资料之间的关系；采用IHC结果分析PAK1和HIF-1α在结直肠癌组织中表达的相关性；探讨PAK1和HIF-1α在结直肠癌侵袭与转移中的作用。3、统计学方法：采用pearsonχ2检验分析PAK1和HIF-1α的表达与结直肠癌病人临床病理参数之间的联系(P<0.05表示结果具有统计学意义)；用McNemar检验分析PAK1和HIF-1α在(?)nRNA和蛋白层面其阳性表达率有无差异(P<0.05表示结果具有统计学意义)；用Spearman等级相关分析法分析PAK1和HIF-1α在蛋白层面表达的相关性(P<0.05表示结果具有统计学意义)。[结果]1、PAK1在正常结直肠粘膜和结直肠癌中的表达：PAK1-mRNA在60例正常结直肠粘膜组织中阳性表达率为8.33%(5/60),在60例结直肠癌组织中阳性表达率为70.00%(42/60),PAK1-mRNA在结直肠癌组织中和正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=47.881P<0.001)；PAK1-蛋白在60例正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率为11.67%(7/60),在60例结直肠癌组织中的阳性表达率76.67%(46/60),PAK1-蛋白在结直肠癌组织中和正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=51.400P<0.001)；PAK1-mRNA与PAK1蛋白在结直肠癌中的阳性表达率差异无统计学意义(χ2=0.682P=0.268)。2、HIF-1α在正常结直肠粘膜和结直肠癌中的表达特征：HIF-1α-mRNA在60例正常结直肠粘膜组织中阳性表达率为20.00%(12/60),在60例结直肠癌组织中阳性表达率73.33%(43/60),HIF-1α-mRNA在结直肠癌组织中和正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=32.257P<0.001)；HIF-1α蛋白在60例正常结直肠粘膜组织中阳性表达率为16.67%(10/60),在60例结直肠癌组织中的阳性表达率为78.33%(47/60),HIF-1α蛋白在结直肠癌组织中和正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=45.750P<0.001);HIF-1α-mRNA与HIF-1α蛋白在结直肠癌中的阳性表达率差异无统计学意义(χ2=0.711P=0.264)。3、PAK1-mRNA和HIF-1α-mRNA的表达与结直肠癌病人临床病理参数之间的联系：ⅠPAK1-mRNA在结肠癌和直肠癌中的阳性表达率差异无统计学意义(χ2=1.564P＝0.211)；HIF-1α-mRNA在结肠癌和直肠癌中的阳性表达率差异无统计学意义(χ2=0.045P=0.832)；ⅠPAK1-mRNA在结直肠癌不同分化程度中的阳性表达率差异无统计学意义(χ2=2.286P=0.130)；HIF-1α-mRNA在结直肠癌不同分化程度中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=10.260P=0.003)；PAK1-mRNA在Dukes不同分期中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=5.876P=0.016)；HIF-1α-mRNA在Dukes不同分期中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=4.705P=0.029)；PAK1-mRNA在有无淋巴结转移的结直肠癌中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=5.876P=0.015)；HIF-1α-mRNA在有无淋巴结转移的结直肠癌中的阳性表达率差异有统计学意义(χ2=4.705P=0.030)。4、PAK1和HIF-1α在结直肠癌中表达的相关性：Spearman等级相关分析PAK1和HIF-1α蛋白在结直肠癌中的表达呈正相关(r＝0.293,P=0.023),PAK1和HIF-1α在结直肠癌中表达的表达具有一定的相关性。[结论]1、PAK1在结直肠癌组织中呈现高表达,PAK1-mRNA在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率；PAK1-mRNA与PAK1蛋白在结直肠癌组织中的表达无显著差异。2、HIF-1α在结直肠癌组织中呈现高表达,HIF-1-mRNA在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于正常结直肠粘膜组织中的阳性表达率；HIF-1α-mRNA与HIF-1α蛋白在结直肠癌组织中的表达无显著差异。3、PAK1-mRNA在结肠癌和直肠癌中的表达无显著差；PAK1在结直肠癌的分化程度中的表达无显著差异；PAK1的高表达与结直肠癌的侵袭和淋巴结转移具有相关性；HIF-1α-mRNA在结肠癌和直肠癌中的表达无显著差异；HIF-1α的高表达与结直肠癌的侵袭、淋巴结转移及分化程度具有相关性。4、PAK1和HIF-1α在结直肠癌侵袭和转移过程中可能存在相互促进作用。