论文部分内容阅读
隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)是一种严重危害人和动物健康的人兽共患寄生原虫，其暴发和流行逐年递增，危害不容忽视。尽管尝试了上千种药物，至今尚无有效的治疗药物。因此，建立灵敏快捷的免疫学检测技术，加强隐孢子虫病的诊断和预防，已经成为当前隐孢子虫病防治工作的重中之重。随着生物技术的成熟和发展，人们发现特异性McAb在各种疾病的诊断和防治发挥了极其重要的作用，也可能为隐孢子虫病的诊断和防治提供重要手段。
为获得高特异性的抗隐孢子虫单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。本研究以原核表达的重组隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)子孢子表面抗原CP15/60为免疫原，免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，用间接ELISA方法进行抗体效价测定，有限稀释法进行亚克隆。以常规染色体分析法进行杂交瘤细胞的染色体分析；用McAb亚类鉴定试剂盒鉴定McAb亚型；间接ELISA法测定相对亲和力及交叉反应性；Western blot检测抗体的特异性。结果获得了8株能稳定分泌抗重组CP15/60(recombinant CP15/60，rCP15/60)的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为A2E4、B6A5、C3H2、G2B7、D8H5、B4F7、E2G4和C6F7，其腹水抗体效价最高达到1∶1×107。对效价最高的B4F7、D8H52株进行进一步的鉴定，结果染色体数目B4F7株为97±4条、D8H5株为90±7条，且观察到标志染色体；抗体亚类均为IgG1，轻链均为κ链；相对亲和力常数B4F7株为0.009μg/mL、D8H5株为0.016μg/mL；2株McAb均与rCP15/60蛋白发生特异性反应，而与柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)卵囊可溶性蛋白、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)裂殖子蛋白以及日本血吸虫(Schistosoma japonicum)虫体蛋白均无交叉反应，表明本试验获得了2株高特异性的抗隐孢子虫McAb。
选取相对亲和力，效价较高的抗隐孢子虫单克隆抗体B4F7株与兔多抗进行双抗体夹心ELISA试验，最终建立了用于检测隐孢子虫卵囊的双抗夹心ELISA，绘制标准，对数据进行回归分析，得到回归方程为y=0.27x-0.01，其中x=log(卵囊数量)，该法最低检测限为128个卵囊/mL，最适检测范围为128～6.3×107个卵囊/mL。通过交叉反应、重复性检测、双盲试验及敏感性试验等，结果表明该双抗体夹心ELISA是敏感性高、特异性强的诊断隐孢子虫病的方法。