1研究背景河南林州(原林县)及其毗邻的地区是世界上食管癌(esophagaeal cancer，EC)发病率和死亡率最高的地区，而且，EC当前仍是该地区肿瘤相关疾病的主要死亡原因。但是，目前食管癌变的分子机制仍不十分清楚。最近有文献报道食管癌的发生发展与个体的心理应激、神经-免疫因素等密切相关。神经系统可经中枢—周围自主神经(交感神经和迷走神经等)通路调节内脏效应细胞。有研究报道，食管闭锁患者迷走神经和喉返神经发育不良；动物实验证实，去除颈段神经嵴或颈交感神经节均可导致食管黏膜缺如和食管闭锁，表明食管与其神经之间在结构和功能上存在着密切关系。近年的临床研究发现，食管癌切除术保留迷走神经，可使患者术后恢复加快，肿瘤复发延迟。西方学者进行大量的研究认为，食管运动功能紊乱所致胃．食管反流可能是导致食管腺癌发生的危险因素之一。这些研究提示，迷走神经功能紊乱或缺陷可能在食管癌变中起着重要的作用。迷走神经的副交感纤维和交感神经通过释放乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)和去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)及其受体(Acetylcholine receptor，AChRs)实现对食管的功能调节。神经生物学研究发现AChRs对细胞增殖、分化、细胞骨架形成具有重要的生理作用，其激动剂尼古丁可促进胶质细胞肿瘤的细胞增殖，而拮抗剂筒箭毒则具有抑制细胞增殖的效应。已有临床调查提示，恶性肿瘤发生与mAChR功能异常有关。还有报道NE可调节中枢神经元的分化类型，亦可诱导人的肺泡细胞系凋亡。但有关神经及其递质对食管癌变的影响，尚未见报道。我们认为食管癌变及其演进是通过多因素、多阶段、多基因的作用，且具有复杂的机制。本实验室多年的研究也提示多个抑癌基因和癌基因以及蛋白质的功能紊乱是导致食管癌变始动的原因，但尚未能发现关键的基因与蛋白分子。食管癌变的好发部位为食管中下段，食管癌前病变并具有双向发展的不稳定特性，提示食管癌变具有可逆性。另有研究发现激活脑干5-HT中缝核—迷走神经通路对内脏具有保护作用，表明中缝核5-HT神经元通过释放5-HT调节着迷走神经的功能。有关心理应激(Stress)的研究发现，长期的心理压力或抑郁可导致脑内5-HT及其受体水平降低，提示应激可影响迷走神经至食管的胆碱能功能下降，进而推测食管病理变化可能与迷走神经至食管神经通路的结构和功能异常有关，而且食管神经功能异常在食管癌变与食管癌细胞恶性转化中占有重要地位。近年的研究提示，EC细胞角质蛋白(Keratin)、氧化还原酶(PRX1)、钙依赖磷脂结合蛋白(Annexin-2)表达异常。Keratin 5和Keratin 20分别为上皮祖细胞和成熟细胞的标志，也是上皮细胞起黏附、支持和保护的功能基础。PRX1对细胞DNA损伤具有修复作用。Annexin-2具有调节细胞分化和抑制细胞增殖的作用等，可能是抑制食管癌变的重要分子之一。AChR和胆碱乙酰基转移酶(CHAT)是ACh作用于细胞的传递分子。微管相关蛋白(MAP2)是神经元的骨架连接蛋白，退行性变的神经元及神经纤维表达减少。上述分子为进一步研究提供了重要的线索和观察的指标。因此，本研究采用组织切片、HE染色、免疫荧光、免疫组化染色等方法对食管癌壁间神经丛的形态与食管癌细胞功能基因与蛋白表达变化进行观察，对其与食管癌变和癌细胞转化的关系予以分析。并进一步采用体外细胞培养法、免疫荧光与免疫组化染色、流式细胞以及RT-PCR技术等探讨交感和副交感神经及其递质NE与ACh对食管癌细胞抑癌基因和功能蛋白表达变化的影响，分析ACh与NE对食管癌变与癌细胞转化的作用，旨在揭示与阐明食管神经及其递质变化在食管癌变中的作用和意义，并为食管癌的靶向防治提供新的研究思路。2材料与方法2．1 EC壁间神经形态与癌细胞功能蛋白表达变化关系的观察42例食管癌标本均来自河南省林州市中心医院和姚村食管癌医院，男性37例，女性5例，其平均年龄为60.3±6.5。所有患者在术前均未接受任何化疗或放疗。经4％的多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片，采用免疫荧光、免疫组化ABC法，对癌、癌旁和正常组织进行免疫组化染色，观察与分析癌、癌旁和正常组织壁间神经形态与癌细胞AChR、ChAT、Annexin-2、PRX1、MAP2、Keratin5和Keratin20表达变化之间以及各功能蛋白表达变化相互之间的关系，以了解食管神经在食管癌变过程中的作用及其变化特点。2．2体外细胞培养实验采用细胞培养法，并借助细胞受体阻断剂(阿托品、托拉唑林)、细胞外基质阻断剂(U0126)对人食管癌细胞株EC9706细胞(郑州大学医学院癌症研究室所保存食管鳞癌细胞株)进行体外培养，应用免疫组化、免疫荧光、MTT、平板细胞克隆、流式细胞、荧光定量RT-PCR等技术方法，观察ACh、NE处理前后EC9706细胞的AChR、ChAT、Annexin-2、Keratin 5和Keratin 20等表达以及细胞增殖周期与增殖活力的变化，分析ACh、NE以及细胞外基质对食管癌细胞增殖和分化的影响与相互关系，以揭示神经递质对食管癌变、癌细胞转化的作用及其可能性分子机制。2．3统计学分析实验数据采用SPSS10.0统计学软件处理，选用单因素方差分析和配对样本t检验。数据资料用(?)±s表示，以a-0.05为检验水准，P＜0.05表示差异有显著意义，P＜0.01表示差异有非常显著意义。3结果3．1食管壁间神经形态与功能蛋白表达的变化及其关系食管壁间神经MAP2阳性强度由正常到增生、原位癌、癌逐渐减淡，细纤维减少至丧失。AChR、ChAT、Annexin-2、PRX1、K20表达随癌变演进和食管壁间神经退行变的加重逐步减少，Keratin 5在癌变过程中变化较小。Keratin 20、Annexin-2的表达变化与PRX1表达一致。AChR表达变化的特征是随癌变的演进开始由胞膜、胞浆随即逐步减少，而后从胞质向核内集中或转移。ChAT在癌变及其恶性转化过程中变化与减少较晚，非典型增生阶段呈现过表达现象。3.2 ACh与NE对人食管癌细胞系细胞增殖、分化的影响3．2．1 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞生长形态的影响应用ACh和NE培养后，可促使细胞体增大，突起长出，核质比下降；NE可使体外培养的食管癌细胞密度降低，细胞突起更长。ACh和NE两组的突起长度与其余各组相比均具有非常显著性差异(P＜0.01)。在mAChR和a受体阻断后，ACh和NE仍具有促进细胞突起生长的作用，两组与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)。ACh和NE组核质比与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)；ACh、NE组受体阻断前、后相比，核质比有所增大，但无显著性差异(P＞0.05)。3．2．2 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞增殖活性的影响ACh和NE均具有降低体外培养食管癌细胞增殖活性的作用，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)；mAChR和a受体阻断后，仍保留有部分降低体外培养食管癌细胞增殖活力的作用。3．2．3 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞增殖抑制率的的影响ACh、NE可提高体外培养食管癌细胞系EC9706细胞增殖抑制率，对细胞增殖具有抑制作用，与对照组相比具有差异显著性(P＜0.05)。受体阻断后，集落形成抑制率仍下降。3．2．4 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞AChR、ChAT、PRX1、Annexin-2、Keratin5和K20表达的影响ACh和NE可促进体外培养食管癌细胞系EC9706细胞的AChR、ChAT、PRX1、Annexin-2、Keratin5和K20表达明显增多，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)；在mAChR和a受体阻断后，仍保留有部分促进体外培养食管癌细胞功能蛋白表达的作用，其中ACh经阿托品阻断mAChR后，与对照组相比，仍较对照组为高，具有统计学意义(P＜0.05)。3．2．5 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞周期与凋亡的影响ACh和NE对细胞周期具有阻滞作用，可使细胞阻滞于G1期或G2期，与对照组相比可使S期癌细胞数量减少，阻滞作用由强到弱，依次为：ACh+NE＞NE加托拉唑林＞NE＞ACh加阿托品＞ACh，阻滞率分别占对照组的90％、70％、15％、15％、10％。ACh和NE具有诱导体外培养食管癌细胞凋亡的作用，诱导癌细胞凋亡率分别是对照组的30倍(ACh)、4倍(ACh加阿托品)、10倍(NE)、20倍(NE+托拉唑啉)、30倍(ACh+NE)。3．2．6 ACh和NE对食管癌细胞系EC9706细胞Annexin-2 mRNA表达的影响ACh和NE可促使体外培养食管癌细胞系EC9706细胞Annexin-2 mRNA表达增多，与对照组相比具有显著性差异(P＜0.05)；ACh、ACh+阿托品、ACh+NE、NE、NE+T的Annexin-2 mRNA表达水平分别比对照组增高20倍、8倍、3倍、2倍、和4倍。3．3 ACh和NE对阻断ERK1／2食管癌细胞系EC9706细胞增殖和分化的影响阻断ERK1／2体外培养食管癌细胞系EC9706细胞形态的突起变短，核质比增大，与对照组相比均有显著差异(P＜0.05)。ACh和NE可使ERK1／2阻断后细胞核质比下降，具有统计学意义(P＜0.05)；变短的突起稍长，但无显著差异(P＞0.05)。阻断ERK1／2体外培养食管癌细胞系EC9706细胞的AChR、ChAT、Annexin-2、Keratin20表达均显著减少(P＜0.05)，加用ACh和NE可使下降的AChR、ChAT、Annexin-2、Keratin20表达增多，具有统计学意义(P＜0.05)。阻断ERK1／2食管癌细胞系EC9706可使细胞的增殖活性下降，细胞增长抑制率提高(P＜0.05)，加用ACh和NE使ERK1／2降低的细胞增殖活性再度下降，细胞增长抑制率再度提高。阻断ERK1／2使体外培养食管癌细胞系EC9706细胞数目在S期阻滞与增多，凋亡细胞百分数减少，ACh和NE可使由ERK1／2阻断引起的S期细胞百分数降低，其作用由强到弱分别为ACh+NE＞ACh+A＞ACh＞NE+托拉唑林＞NE。4结论4．1食管壁间神经纤维在癌变演进过程中逐渐减少或丧失，AChR、ChAT、Annexin-2、PRX1、K20随癌变的表达逐步减少。结果提示，食管壁间神经减少或功能丧失可能是食管癌变的神经因素。AChR随癌变始动与演进的特征性变化是其在胞膜、胞浆的含量减少最早，并从胞质向核内集中或转移，这可能是引起食管黏膜上皮细胞对神经性ACh敏感度下降，进而导致癌变启动较早的受体事件。PRX1表达增多可能是受伤害刺激的细胞维持Annexin-2和Keratin20表达有效分子，其表达下降可能是导致细胞自身保护和稳定功能下降，细胞癌变与癌细胞恶化的内在原因。4．2ACh和NE具有诱导体外培养的人食管癌细胞系EC9706细胞分化的作用，采用阿托品和妥拉唑啉分别阻断mAChR和α受体，仍具有促进EC9706细胞分化的作用。结果提示，食管癌细胞具有经诱导分化或增强分化的能力，ACh和NE可促使细胞体增大，突起长出，核质比下降，功能蛋白表达增多，其机制可能是主要通过nAChR和β受体。4．3 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞增殖活性具有降低的作用，表现为将癌细胞由S期向G1和G2期诱导，或使其周期发生阻滞，影响细胞的增殖，该作用经多受体、多途径韵调节。4．4 ACh和NE对体外培养食管癌细胞系EC9706细胞Annexin-2 mRNA表达具有促进作用。ACh作用最强，可使其表达量增加20倍，ACh+阿托品使之增加8倍，NE、NE+托拉唑啉、ACh+NE作用较弱，仅能使之表达增加2～4倍。4．5 ERK1／2阻滞剂除具有降低细胞增殖和阻滞细胞分化的作用。ACh和NE对阻断ERK1／2体外培养食管癌细胞系EC9706细胞的增殖活性具有再度降低的作用，并通过调节癌细胞功能蛋白的表达而诱导细胞分化。神经递质与细胞外基质阻断剂相互作用的发现为进一步揭示食管癌在体内发生发展的分子机制提供了新的研究思路和方向，并为食管癌防治的药物设计提供了新的靶点。