沙门菌（Salmonella）是一种侵袭性的、兼性细胞内致病菌,具有在多种寄生宿主体内进行定植的能力。其中,鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）是一种较常见的重要人兽共患病原菌,宿主谱十分广泛,食入该菌污染的食物和饮水可以引起人和动物的胃肠道疾病。近年来,随着兔业养殖的发展,沙门菌在家兔致病上比较常见,病原菌主要为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,不同品种不同年龄的家兔均可被感染。鼠伤寒沙门菌感染兔群后,除引起母兔流产死亡,幼兔腹泻,还可对兔的皮毛制品、肉制品等造成污染。兔沙门菌病的发生和流行,不仅给家兔产业带来巨大的经济损失,也会带来严重的公共卫生安全问题。在全球范围内,鼠伤寒沙门菌每年引起超过数百万人的感染,严重威胁人类健康。研究表明,沙门菌的致病性与其毒力因子密切相关。沙门菌之所以能在宿主体内生存、繁殖和扩散主要是因为有大量毒力相关基因的存在及相互作用而使宿主感染发病。一直以来对沙门菌致病及防治的研究备受人们的关注,如何更好的防控畜禽沙门菌及保护人类健康已成为国际公共卫生关注的一个热门课题。通过构建沙门菌单个或多个毒力基因缺失株研制更稳定的减毒沙门菌疫苗等非常重要,研究并防治沙门菌感染对医学、兽医公共卫生和食品安全等具有重要的社会效益。本研究从陕西杨凌、宝鸡、武功三个兔场中,以出现母兔流产、死亡、腹泻为主要临床表现及剖检肝脾肿大、肠道鼓气的病死兔,采集其肝脏、脾脏及粪便,通过细菌分离培养方法获得疑似沙门菌菌株五株,对其进行了挑纯、生化试验、分子生物学鉴定和动物致病性试验分离到鼠伤寒沙门菌;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了鼠伤寒沙门菌毒力基因Sop B和Ssr B的敲除载体,成功构建筛选获得鼠伤寒沙门菌△Sop B、△Ssr B和△Sop B-Ssr B基因缺失突变株,并进行了小鼠致病性试验。为建立鼠伤寒沙门菌CRISPR/Cas9基因精确编辑技术提供基础,同时探索鼠伤寒沙门菌基因缺失突变株作为减毒活疫苗或载体的可行性,为沙门菌减毒疫苗的研制提供参考。试验结果如下:1.从三个兔场获得的疑似沙门菌菌株在麦康凯琼脂平板上呈中等大小,透明或半透明,圆形,光滑微凸起的菌落;在SS琼脂平板上呈圆形,中心有小黑点或几乎全呈黑色状,边缘整齐,光滑的菌落。生化试验和特异性PCR检测结果确定有三株分离菌株为鼠伤寒沙门菌（Y3,B2,W1）。药敏试验结果表明分离菌株对青霉素、万古霉素、四环素、红霉素等几乎均有强耐药性,对妥布霉素、氯霉素、卡那霉素等有耐药性,对链霉素、庆大霉素等均敏感,且三个兔场分离的沙门菌株耐药性还有一定差异。分离菌株感染幼兔试验能引起兔腹泻及精神萎靡等临床症状,病死兔剖检重新分离到鼠伤寒沙门菌,经PCR鉴定结果一致。从三个兔场采集的粪便样本经PCR检测出鼠伤寒沙门菌感染率在30%～47%之间2.利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,通过不断筛选最优sg RNA,建立了基于鼠伤寒沙门菌毒力基因Sop B和Ssr B的含有Cas9、sg RNA和同源臂序列的重组敲除载体,形成一种更加有效的基因编辑。通过电转化的方法将重组载体转入鼠伤寒沙门菌,成功构建并筛选获得鼠伤寒沙门菌基因缺失突变株△Sop B、△Ssr B和△Sop B-Ssr B。3.鼠伤寒沙门菌野生株和缺失株△Sop B、△Ssr B和△Sop B-Ssr B的生物学特性和毒力试验中,结果显示,与野生株相比,缺失株△Sop B和△Sop B-Ssr B在生长速度和运动活力上相对缓慢,而缺失株△Ssr B与野生株相比生长速度和运动活力没有明显变化。小鼠致病性试验中三株缺失株的LD50都比野生株高10～42倍,表明缺失株毒力有所下降,双重基因缺失株△Sop B-Ssr B较两株单重缺失株△Sop B和△Ssr B毒力减弱效果并不明显。以上研究结果表明,兔场沙门菌感染率相对严重,尽管兔场的饲养管理措施和防控到位,但依然存在漏洞。本研究构建的三株鼠伤寒沙门菌基因缺失株毒力有所减弱,能够降低对小鼠的致病性,以期为深入研究鼠伤寒沙门菌减毒疫苗或作为疫苗载体提供参考;双重基因缺失株较单重基因缺失株的减毒效果没有达到预期需要进一步试验及严格筛选毒力候选基因。