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嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)是一种化能自养嗜酸性革兰氏阴性细菌,可以通过氧化亚铁离子与硫单质或含硫化合物获得能量生长。A.ferrooxidans是目前使用最广泛,研究最深入的浸矿微生物。A.ferrooxidans对能源基质的氧化利用主要发生在细胞周质空间内,但由于对A.ferrooxidans单质硫氧化过程的相关研究相对缺乏,目前还并不确定氧化元素硫的蛋白作用机制,对其周质空间的研究能大大简化研究步骤提高效率。本论文以蛋白总量和苹果酸脱氢酶活性为两个重要指标,对比了已有周质蛋白提取方案的提取效率和胞质蛋白污染情况,最终确定渗透休克法为提取A.ferrooxidans周质蛋白最适合方法,并以胞质蛋白污染尽可能少为原则,针对A.ferrooxidans ATCC 23270周质蛋白提取对渗透休克法的渗透液作用时间,高渗液与低渗液的摩尔比例以及渗透液总体积进行了适当优化并对优化结果进行了验证。优化结果为:对于0.1克(湿重)细胞,渗透液的作用时间为15 min,高渗液与低渗液的摩尔比为1:1,渗透液的总体积为10 mL。研究了双向电泳上样量,等电聚焦电压以及SDS-PAGE电流,确定了适合于A.ferrooxidans周质蛋白的双向电泳条件为:双向电泳的上样量300μg,等电聚焦电压设定为30 V,12 h;500 V,5 h;1000V,1 h;3000 V,30 min;5000 V,30 min;7000 V,1 h;8000 V,6 h。第二向电流为单片凝胶电泳时电流设定为10 mA,60 min;25 mA,7h。利用优化的渗透休克法对单质硫培养基下不同生长时期的A.ferrooxidans抽提周质蛋白后进行双向电泳,得到电泳图谱后进行初步对比分析发现:对数期和稳定期的周质蛋白多为分子量较小的碱性蛋白,稳定期中有些蛋白斑点消失,但也出现了一些分子量相对较大的蛋白斑点;衰亡期中,由于细胞凋亡,细胞周质蛋白提取液中明显包含胞质蛋白,双向电泳谱中蛋白斑点也明显增多。这些结果为进一步研究周质空间内功能性蛋白奠定了基础。