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卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指正常发育的妇女在40岁以前因某种原因引起的卵巢功能衰竭,表现为原发(继发)性闭经、低雌激素(E2<25 pg/ml)和高促性腺素(FSH>40 IU/L、LH>30 IU/L)状态,习惯称之为早绝经。POF的相关病因复杂,研究发现,POF的发生与遗传因素、免疫因素、代谢因素、病毒感染、物理因素、化学因素、卵巢手术及社会生活的压力等因素密切相关,但也有一部分发病为特发性,无明确病因。目前POF发病机理尚不清楚,故无确切有效的治疗方法,常用的激素替代疗法(HRT)、免疫抑制剂、卵巢活组织移植术等仍不乐观。本研究利用POF动物模型及脐血单个核细胞的多向分化潜能及低免疫原性的特性,探讨人脐血单个核细胞(HCMNCs)移植治疗卵巢早衰动物模型的可行性及疗效,进一步为POF患者寻找新的治疗方法提供实验依据。第一部分放射性卵巢早衰裸鼠模型的构建目的:探讨放射性因素构建卵巢早衰裸鼠模型的可行性及所需放射线的最佳照射剂量。方法:1、取7～8周龄BALB/C裸鼠80只,随机分为A、B、C、D、E五组。2、A组为空白对照组,B、C、D组分别予0.3Gry、0.5Gry、0.7Gry钴60γ射线照射,E组为双侧卵巢去势组。3、每天行阴道脱落细胞涂片观察各组裸鼠动情周期变化情况。分别于处理后第15及第30天每组随机处死8只裸鼠,取血清ELISA法测定血清中E2、FSH、LH水平变化,并取卵巢组织行H-E染色,观察卵巢卵泡数目变化。结果:1、裸鼠一般情况观察:A组裸鼠活动、进食等无明显变化,B、C、D组裸鼠活动频度逐渐减少,进食少,对外界的刺激反应淡漠,随时间延长,表现更明显,E组裸鼠活动少,进食少,反映淡漠更明显。2、A组裸鼠动情周期无明显变化,B、C、D组裸鼠动情周期出现不同程度的紊乱,而E组动情周期的变化基本消失,B、C、D、E组动情周期的变化与A组相比均有统计学意义(P<0.05),B、C、D、E各组间无显著性差异(P>0.05)。3、处理后第15天,B、C、D、E组裸鼠血清中E2较A组明显降低,FSH、LH升高,且有统计学意义(P<0.05),随着时间的延长,这种差异更明显。结论:钴60γ射线照射可成功构建裸鼠卵巢早衰的动物模型,以0.5Gry照射剂量为佳。第二部分脐血单个核细胞移植治疗放射性裸鼠卵巢早衰的实验研究目的:探讨人脐血单个核细胞(HCMNCs)移植治疗放射性卵巢早衰裸鼠模型的可行性及疗效。方法:1、取7～8周龄BALB/C裸鼠105只,随机分为A、B、C三组。2、A组未予任何处理,B、C两组予钴60γ射线0.5Gry照射以达到使裸鼠卵巢发生功能衰竭,建立POF模型。3、每天行阴道脱落细胞涂片观察各组裸鼠动情周期变化。于照射后第30天时每组处死15只裸鼠,取血清ELISA法测定血清中E2、FSH、LH水平变化,并取卵巢组织行H-E染色,观察卵巢卵泡数目变化。确定POF造模成功。4、以Ficoll密度梯度离心法制备HCMNCs细胞悬液,并以BrdU标记。5、确定POF造模成功后,将制备的BrdU标记的HCMNCs细胞悬液注入C组裸鼠的双侧卵巢内,B组剩余裸鼠双侧卵巢各注入10ul L-DMEM培养基,A组剩余裸鼠未予特殊处理。6、移植后4周,将各组裸鼠全部处死,取血清ELISA法测定血清中E2、FSH、LH水平变化,并取卵巢组织行HE染色、BrdU组化染色,观察卵巢卵泡数目变化及移植细胞成活情况。结果:1、裸鼠一般情况观察:经钴60γ射线照射后,B、C组裸鼠活动频度逐渐减少,进食少,对外界的刺激反应淡漠,A组裸鼠无明显变化;人脐血单个核细胞移植后,C组裸鼠一般情况较移植前及B组有所好转。2、钴60γ射线照射后,B、C组裸鼠动情周期出现不同程度的紊乱,而A组裸鼠的动情周期无明显变化;人脐血单个核细胞移植后,C组裸鼠的动情周期紊乱较B组明显好转,开始出现上皮细胞、角化细胞、白细胞交替的变化情况,随时间延长周期性更明显。3、钴60γ射线照射后30天,B、C组裸鼠血清中E2明显低于对照组A组,有统计学意义(P<0.05),FSH、LH较对照组A组明显升高,有显著性差异(P<0.05)。4、显微镜观察及统计学分析表明,与对照组A组相比,钴60γ射线照射的B、C组裸鼠卵巢组织中原始卵泡和早期生长卵泡的数量明显减少(P<0.01)。5、脐血单个核细胞移植4周后,移植组C组裸鼠血清中E2较POF组B组明显升高,FSH、LH较POF组(B组)明显降低,均有显著性差异(P<0.05),与空白对照组A组无显著差异(P>0.05)。6、免疫组化示移植的单个核细胞可在裸鼠卵巢内定居并存活。结论:人脐血单个核细胞(HCMNCs)可成功植入卵巢早衰的裸鼠体内,存活并能改善其卵巢的功能。