以生鲜牛肉为原料提取肌红蛋白(Mb),并对提取条件进行优化。以提取的肌红蛋白作为研究对象,采用紫外光谱扫描(UV)和高效液相色谱法(HPLC)研究不同理化因素、添加剂和内源性物质对肌红蛋白及血红素辅基作用的规律。本研究可分为3个部分,具体研究内容和结果如下:1.牛肉肌红蛋白的提取与纯化将牛肉切碎后,取100g肉糜与300mL冷的萃取介质(50mmol/LTris-HCl,pH 8.0)混匀,混合液于10000 r/min下匀浆1 min后以9600 g转速离心15 min,离心后取上清液并用75%饱和度的硫酸铵盐析1 h,盐析后的混合液在10000 r/min下离心30 min,离心后将粉红色的上清液置于透析袋中(截留分子量7000 Da),通过10倍体积冷的50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)透析24h除去硫酸铵,透析袋置于冷冻恒温摇床中(转速为100r/min),在此期间透析液更换10次,即得到肌红蛋白的粗提物,所有的提取过程均在4 ℃条件下进行。粗提液经sephadex G200凝胶柱分离纯化,收集纯化后的肌红蛋白溶液经过SDS-PAGE电泳分析得到较纯的一个条带。为了提高肌红蛋白的提取效率,本文首先对提取过程进行优化,选取pH8.0的Tris-HCl作为提取肌红蛋白的缓冲液,盐析的硫酸铵饱和度为75%。2.不同理化因素对肌红蛋白稳定性影响的规律通过紫外光谱扫描和高效液相色谱分析时间、温度、pH、氯化钠和次氯酸钠对肌红蛋白及其血红素辅基稳定性的影响。实验结果表明,随着时间的延长,OxyMb百分比含量逐渐降低,MetMb含量逐渐升高,血红素辅基损失逐渐增大;温度的升高会加快肌红蛋白的氧化速率,但对血红素辅基结构的稳定性影响不是很明显;肌红蛋白在偏碱性条件下较稳定,酸性环境下肌红蛋白的氧化速度加快,pH<7.0时,pH越低,肌红蛋白氧化速率越快;血红素辅基在偏碱性环境下较稳定,而酸性环境中血红素辅基损失速率明显提高;一定范围内,盐度不会明显加快肌红蛋白的氧化速率,对血红素辅基结构稳定性的影响也不是很明显;次氯酸钠能极大地加快肌红蛋白的氧化速率,破坏血红素辅基的结构,并且随着时间的延长,这种作用逐渐增强。3.内源性物质对肌红蛋白稳定性影响的规律肉品中存在乳酸、多种金属离子和脂肪酸,通过紫外光谱扫描和高效液相色谱分析乳酸、金属离子和脂肪酸对肌红蛋白及其血红素辅基稳定性的影响。紫外光谱扫描和高效液相色谱实验结果说明,乳酸能明显地加快肌红蛋白的氧化速率,破坏血红素辅基的结构,并且随着时间的延长,这种作用越强;选取的四种常见金属离子中,Cu2+的添加明显促进了肌红蛋白的氧化,随着Cu2浓度的不断增大,OxyMb百分比含量逐渐降低,MetMb百分比含量逐渐升高,同时高效液相色谱分析结果显示,Cu2+会降低血红素辅基的稳定性,Fe2+在一定程度上会增加其稳定性,而Mg2+和Mn2+对其作用不明显;不同脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、肉豆蔻酸)在不同程度上加快了肌红蛋白的氧化速率,其中亚油酸和亚麻酸作用效果最明显,棕榈酸作用效果较弱,脂肪酸同样能加快血红素辅基的损失,其中不饱和度高的脂肪酸引起肌红蛋白血红素的损失更大。