钩吻(Gelsemium elegans Benth,GEB)是马钱科胡蔓藤属植物,又名断肠草、猪人参、大药茶等。它的主要活性成分为生物碱,包括钩吻素子(Koumine,Kou)、钩吻素甲、钩吻素寅、钩吻素卯和钩吻素丙等,具有抗肿瘤、止痛、抗炎、免疫调节和抗焦虑等多种生物学功能。其中,Kou的含量最为丰富,具有与钩吻总碱相似的生物学功能,但毒性相对较小。针对钩吻在猪和人机体出现的不同现象以及其抗肿瘤的现象,我们将Kou作为研究对象,从细胞水平上揭示Kou对猪细胞和人细胞的不同调节作用以及其抗肿瘤的分子机理。此外,还构建了四环素(Tetracycline,Tet)诱导利用Tet-on诱导表达系统调控的Vero-TR母细胞,建立Tet诱导表达或沉默DEC1的Vero细胞系,作为一种后续研究的工具。主要的研究内容包括:1.研究Kou对猪细胞和人细胞的不同调节作用首先,在显微镜下观察Kou对猪细胞(PK15和IPECJ2细胞)和人细胞(H1299、RKO和MCF7细胞)的细胞形态变化的影响。其次,通过流式细胞术检测了 Kou对不同细胞的生长周期的影响。进一步采用细胞生长曲线和细胞集落形成试验分析了Kou对不同细胞生长的影响,同时Western Blot检测细胞中PARP1蛋白的表达情况。结果显示,Kou能够使人的细胞(H1299、RKO和MCF7)发生不同程度的细胞形态的变化,甚至出现细胞死亡。相比之下,猪的细胞不出现或出现轻微的细胞形态变化。流式细胞术结果显示,Kou使PK15和IPEC-J2细胞的生长周期阻滞在G1期,而使H1299、RKO和MCF7细胞的生长周期阻滞在G2/M期。通过细胞生长曲线和细胞集落形成试验,我们发现Kou可以显著抑制人细胞的增殖,而且这种抑制是不可逆的。而Kou对猪细胞生长的抑制并不明显,且这种抑制是可逆的。Western Blot的结果显示,Kou可以使RKO和MCF7细胞中的PARP1蛋白发生剪切,导致细胞的死亡。而Kou对猪的细胞中PARP1蛋白表达的无明显影响。2.研究Kou抗肿瘤活性的分子机理研究发现,Kou能够诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤的作用。通过Western Blot的方法,我们检测了不同肿瘤细胞中,促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2、胱天蛋白酶7(Caspase7)和PARP1蛋白的表达情况。同时通过分离线粒体和细胞质的方法,检测了细胞色素C在细胞内的位置。结果发现,Kou可以引起RKO和MCF7细胞中Bax蛋白表达量的增加以及Bcl-2蛋白表达量的降低,并使细胞色素C由线粒体释放到胞质中,使细胞内的Caspase7和PARP1蛋白发生剪切,最终出现细胞的凋亡,而在Vero和H1299细胞没有检测到相应的变化。因此,Kou可以通过线粒体凋亡途径诱导RKO和MCF7细胞的凋亡。3.四环素调控DEC1表达的Vero细胞系的的构建试验将表达Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein,TetR)的pcDNA6转染至Vero细胞,通过Blasticidin筛选稳定表达TetR的阳性细胞克隆,即Vero-TetR母细胞系。将克隆有DEC1基因CDS区的pcDNA4真核表达载体或克隆有特异性靶向DEC1基因的shRNA的pBabe-Hl真核表达载体,分别转染至Vero-TR细胞,通过Zeocin或Puromycin筛选诱导表达或沉默DEC1的阳性细胞克隆,命名为Vero-DEC1和Vero-siDEC1。利用Wetern Blot检测Vero细胞中Tet诱导表达或沉默DEC1的效果。最后成功构建了 Vero-TR、Vero-DEC1和Vero-siDEC1的稳定细胞系,WesternBlot结果显示DEC1能够在Tet的调控下有效表达或沉默。本研究以Kou为研究对象,我们发现了其对人细胞和猪细胞具有不同的调节作用,同时,它还可以通过线粒体凋亡途径诱导RKO和MCF7细胞的凋亡,对不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性也有所差异。最后,Vero-TR母细胞系的成功构建为建立其他宿主细胞基因表达或沉默的细胞系提供了重要材料,Vero-DECl和Vero-siDEC1细胞系的成功构建为研究DEC1在正常或感染等应激情况下的生物学功能奠定了基础。