2型糖尿病是冠心病的等危症,血管并发症的发生是糖尿病患者出现高致残率、高致死率的主要原因。冠心病与血瘀证关系密切,糖尿病高血糖状态下存在的高血粘度现象以及伴随局部血栓形成的血管并发症是中医“血瘀”的具体体现。以陈可冀院士为首的课题组一直致力于血瘀证实质的探索,前期通过纳入冠心病血瘀证患者并应用寡核苷酸基因芯片技术成功构建了冠心病血瘀证白细胞差异基因表达谱,同时进一步深入分析发现,其中的差异基因蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)位于冠心病血瘀证疾病网络的关键调控环节。机体血糖水平过高是导致糖尿病血管病变发生的主要病理因素。高血糖状态下,血糖的急剧波动更容易诱发血管内皮损伤和血管并发症的发生。这已成为现阶段糖尿病预防和治疗研究领域的热点之一。蛋白激酶C(PKC)途径被认为是糖尿病血管病变的关键机制。那么,作为冠心病血瘀证关键调控基因的PKCβ1是否也在具有明显血瘀证证候特点的糖尿病血管并发症,特别是波动性高血糖诱导的血管内皮损伤中发挥重要作用呢?机体“血瘀证”状态往往伴随着体内血小板的高聚集活化,那么,在具有明显血瘀征象的糖尿病患者体内,血糖波动性的增加是否会对其机体的血小板聚集活化产生影响?作为冠心病血瘀证关键调控分子的PKCβ1又与其具有怎样的关系呢?赤芍、川芎作为具有代表性的活血化瘀中药,广泛用于血瘀证的临床治疗并取得良好疗效。芍药苷、川芎嗪分别是赤芍、川芎的有效部位,现代药理研究发现其均具有较好的保护血管内皮、抑制血小板聚集活化、抗动脉粥样硬化以及防治冠心病介入术后支架再狭窄等作用。那么,其保护血管内皮功能、抗血小板聚集活化的作用是否与调控PKCβ1基因有关?其在波动性高血糖继发血管病变效应中是否也发挥重要作用呢?本研究通过纳入2型糖尿病患者,观察血糖波动幅度与2型糖尿病患者血小板活化、血管内皮损伤及PKCβ1表达的相关性；体外构建波动性高血糖诱导损伤人脐静脉内皮细胞实验模型和人血小板—脐静脉内皮细胞实验体系,观察赤芍川芎有效部位对波动性高血糖损伤血管内皮的保护效应以及PKCβ1表达变化的情况,探讨波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞损伤培养液温育对人外周血血小板聚集的影响以及PKCβ1在其中所扮演的角色；体内动物实验通过引入“升糖指数”(Glucose Index, GI)的概念,构建2型糖尿病大鼠波动性高血糖和稳定性高血糖模型,观察赤芍川芎有效部位对血糖波动状态下2型糖尿病大鼠血管内皮功能、血小板聚集活化以及冠心病血瘀证关键调控分子PKCβ1表达的影响,探讨赤芍川芎有效部位拮抗波动性高血糖介导内皮损伤和血小板过度活化的相关机制,为活血化瘀中药防治糖尿病血管并发症的临床应用提供实验依据。本课题研究包括以下两部分：文献综述和实验研究。1文献综述：本部分从“糖尿病血管病变、血瘀证与活血化瘀”、“波动性高血糖、血管内皮损伤与血小板过度活化”和“PKCβ与糖尿病血管病变研究进展”三个方面进行综述。2实验研究：包括以下五个部分。研究一2型糖尿病患者血糖波动状态与血管内皮损伤、血小板活化及PKCβ1表达的相关性研究目的：明确血糖波动状态与血管内皮损伤、血小板活化及PKCβ1表达的相关性。方法：2型糖尿病诊断标准按照2010年中华医学会糖尿病学分会的《中国2型糖尿病防治指南》进行。筛选符合入选标准的2型糖尿病患者38例作为研究对象。在未进行药物干预措施调整之前,进行七点法指端毛细血管血糖测定[三餐前(早餐前(空腹)、午餐前、晚餐前,三餐后2h及睡前9点]来计算平均血糖波动幅度(MAGE);采血测定外周血血小板最大聚集率和血小板膜蛋白CD62p表达；采用离子交换高压液相法检测糖化血红蛋白(HbA1c)水平；采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清E-选择素(E-selectin)、血管性血友病因子(vWF)和蛋白激酶C β1(PKCβ1)水平；同时,进行其他一般性指标检测。以HbA1c作为评价长期血糖控制的监测指标,MAGE作为评价血糖波动性的指标,并观察血清E-selectin水平、血清vWF水平、血小板最大聚集率和血小板膜蛋白CD62p表达分别与血清PKCβ1水平和MAGE以及血清PKCβ1水平与MAGE和HbA1c水平之间的相关性。结果：入组患者的年龄、体重、病程、病史等一般资料与血清E-selectin、血清vWF、血清PKCβ1、血小板最大聚集率、血小板膜蛋白CD62p表达和MAGE之间均无显著相关性；内皮损伤标志物血清E-selectin和血清vWF水平、血小板最大聚集率和血小板膜蛋白CD62p表达与MAGE之间均存在显著相关性(P<0.01)；冠心病血瘀证目标分子PKCβ1与血糖评价指标(MAGE和HbA1c)、内皮损伤标志物(E-selectin和vWF)、血小板最大聚集率和CD62p表达水平之间均存在显著相关性(P<0.05或P<0.01),均可以建立回归方程。结论：冠心病血瘀证关键调控分子PKCβ1与糖尿病患者血糖波动状态下的血管内皮损伤程度和血小板活化聚集水平密切相关。研究二波动性高血糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤过程中PKCβ1表达及赤芍川芎有效部位的干预效应研究目的：观察波动性高血糖对人脐静脉内皮细胞损伤过程中PKCβ1表达的影响及赤芍川芎有效部位的干预效应。方法：以体外培养HUVECs作为研究对象,实验共分为以下9组：正常低糖组(N组)：以低糖型DMEM (5.56mmol/L)培养基进行培养,每24h更换一次培养基；稳定性高糖组(W组)：以高糖型(25mmol/L) DMEM培养基进行培养,每24h更换一次培养基；波动性高糖组(B组)：以低糖型DMEM全培养基/高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次；稳定性高糖+LY333531组(WL组)：采用PKCβ1阻断剂LY333531预处理1h后,以高糖型DMEM培养基进行培养,每24h更换一次培养基；波动性高糖+LY333531组(BL组)：采用PKCβ1阻断剂LY333531预处理1h后,以低糖型DMEM全培养基/高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次；波动性高糖+川芎嗪组(TMP组)：以低糖型DMEM全培养基/高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次,并应用盐酸川芎嗪(TMP,500μM)进行干预；波动性高糖+芍药苷组(PAE组)：以低糖型DMEM全培养基/高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次,并应用芍药苷(PAE,100μM)进行干预；波动性高糖+盐酸二甲双胍组(MH组)：以低糖型DMEM全培养基/高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次,并应用盐酸二甲双胍(MH,1mM)进行干预；波动性高糖+阿司匹林组(ASA组)：以低糖型DMEM全培养基/高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次,并应用阿司匹林(ASA,1mM)进行干预。细胞培养8d,采用倒置相差显微镜进行细胞形态学观察,采用流式细胞术检测细胞活性和凋亡。收集细胞培养上清液,应用ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)、活性氧(ROS)含量和总抗氧化能力(T-AOC);应用Western blot法检测细胞PKCβ1蛋白表达。结果：1.细胞形态学观察：与N组相比,W组和B组细胞明显肿胀、凋亡和坏死,且B组较W组更显著。应用LY333531抑制PKCβ1表达后细胞状态明显好转。应用TMP、PAE、MH和ASA干预后,细胞状态较B组均有不同程度改善。2.细胞活性和凋亡水平检测：与N组相比,B组和W组细胞活性显著下降、细胞总凋亡率(以晚期凋亡为主)明显升高(P<0.01),且B组较W组更显著(P<0.05或P<0.01)。应用LY333531阻断后,WL组和BL组细胞总凋亡率均显著下降(P<0.05或P<0.01)；TMP、PAE、MH和ASA干预亦可显著降低细胞的总凋亡率(P<0.01),其中PAE对早期凋亡(P<0.01)和晚期凋亡(P<0.01)均具有显著抑制效应。3.炎症反应和氧化应激相关指标检测：与N组相比,W组和B组细胞TNF-α、 PECAM-1、ROS含量均显著增多(P<0.01), T-AOC显著下降(P<0.01)；与W组比较,B组细胞TNF-α、PECAM-1含量又有进一步升高(P<0.01,P<0.05),T-AOC进一步降低(P<0.01)；应用LY333531阻断后,WL组和BL组细胞TNF-α、 PECAM-1、ROS水平出现显著下降(P<0.05或P<0.01),同时伴T-AOC显著升高(P<0.05或P<0.01)；TMP、PAE、MH和ASP干预与LY333531效应相似。4.细胞PKCβ1蛋白水平检测：与N组相比,W组和B组细胞PKCβ1蛋白表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),B组较W组又出现明显升高(P<0.05)；应用LY333531阻断后,WL组和BL组细胞PKCβ1蛋白表达水平明显降低(P<0.01)；TMP、PAE、MH和ASA干预与LY333531具有相似效应。结论：波动性高血糖能够显著诱导并加重人脐静脉内皮细胞损伤和凋亡,且该效应与PKCβ1过表达密切相关；赤芍川芎有效部位对波动性高血糖状态下的血管内皮功能损伤具有明显的保护作用,该作用机制与其显著抑制PKCβ1表达进而减轻氧化应激和炎症反应密切相关。研究三波动性高血糖对人血小板聚集活化的影响及赤芍川芎有效部位和PKCβ1抑制的干预效应研究目的：观察波动性高血糖对人血小板聚集活化的影响及赤芍川芎有效部位和PKCβ1抑制的干预效应。方法：首先,予人脐静脉内皮细胞以不同条件葡萄糖进行培养：正常低糖组(N组)：以低糖型DMEM (5.56mmol/L)培养基进行培养,每24h更换一次培养基；稳定性高糖组(W组)：以高糖型(25mmol/L) DMEM培养基进行培养,每24h更换一次培养基；波动性高糖组(B组)：以低糖型DMEM全培养基／高糖型DMEM全培养基培养,每24h交替更换一次。连续培养8d后,收集细胞上清液,置于-80℃冰箱中储存备用。其次,选取健康志愿者15例,于清晨进食前使用BD枸橼酸钠抗凝(1：9)真空采血管采集10mL空腹全血,以1000r/min离心10min收集富血小板血浆(PRP),3000r/min离心10min,提取贫血小板血浆(PPP)。最后,将第一步收集到的不同培养条件培养的细胞上清液作为诱导剂加入收集到的PRP中进行血小板最大聚集率的检测。同时,应用PKCβ1阻断剂LY333531以及TMP.PAE.MH和ASA对不同组血小板进行预处理15min。实验共计分为以下9组：正常低糖组(N组)、稳定性高糖组(W组)、稳定性高糖+LY333531组(WL组)、波动性高糖组(B组)、波动性高糖+LY333531组(BL组)、波动性高糖+川芎嗪组(TMP组)、波动性高糖+芍药苷组(PAE组)、波动性高糖+二甲双胍组(MH组)和波动性高糖+阿司匹林组(ASA组)。结果：与N组相比,W组和B组健康人外周血血小板最大聚集率均明显增高(P<0.01),且B组较W组又有显著升高(P<0.01)；而应用PKCβ1阻断剂LY333531以及TMP、PAE、MH和ASA药物预处理15min后,波动高糖诱导的血小板最大聚集率均显著下降(P<0.01)。结论：波动性高血糖诱导人脐静脉内皮损伤培养液温育具有显著促进健康人血小板聚集的作用,PKCβ1抑制剂及赤芍川芎有效部位对此均具有显著的拮抗效应,赤芍川芎有效部位的抗血小板聚集效应可能与其抑制PKCβ1表达相关。研究四2型糖尿病大鼠血糖波动模型的建立目的：建立2型糖尿病大鼠血糖波动模型。方法：SD大鼠30只,普通饲料适应性喂养1w后,开始高糖高脂喂养,喂食方式采用定时定点投食,每日8：00-9：00、14：00-15：00和20：00-21：00共计三次,每次持续1h。4w后,按30mg/kg剂量一次性予以腹腔注射链脲佐菌素(STZ,使用柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液进行配制,pH4.4), STZ注射3d后连续测定造模大鼠空腹和餐后血糖,以空腹血糖大于11.1mmol/L且餐后血糖不大于33.3mmol/L作为入组标准,成功纳入符合要求的2型糖尿病(T2DM)大鼠16只。根据血糖和体重水平将成功纳入的T2DM大鼠分为两组：高GI饮食组和低GI饮食组。仍采用定时投食的方法,正常组喂以基础饲料,高GI组喂以高GI饲料,低GI组喂以低GI饲料。同时,采用尾静脉采血法测定各组大鼠三餐前和餐后2h血糖,连续测定5d。实验完成后,腹主动脉采血,分离血清用于空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TC)、胰高血糖素(glucagon)和胰岛素(insulin)水平的检测并计算胰岛素敏感指数(Insulin Sensitive Index, ISI)。结果：1.体重及血清生化指标：与正常组相比,高GI饮食组和低GI饮食组糖尿病大鼠体重以及血清FBG、TC和TG水平均明显升高(P<0.05或P<0.01),且两组差异无统计学意义(P>0.05)。2.血清glucagon、insulin和ISI水平：与正常组相比,高GI饮食组(波动组)和低GI饮食组(稳定组)大鼠血清glucagon和insulin水平均显著升高,ISI显著降低(P<0.01),且两组差异无统计学意义(P>0.05)。3.血糖波动情况：与正常组相比,高GI饮食组和低GI饮食组糖尿病大鼠MAGE和最大血糖波动幅度(LAGE)均出现较大幅度升高(P<0.01)；与低GI饮食组比较,高GI饮食组MAGE和LAGE的增高幅度更为明显(P<0.05,P<0.01)。结论：在不影响大鼠整体血糖水平的情况下,高GI饮食组糖尿病大鼠比低GI饮食组大鼠具有更加明显的血糖波动。运用高GI饮食和低GI饮食喂养2型糖尿病大鼠可以成功构建2型糖尿病大鼠血糖波动模型,且该模型可保证2型糖尿病大鼠血糖相对稳定。研究五赤芍川芎有效部位对波动性高血糖大鼠血管内皮损伤过程中血小板活化及PKCβ1表达的影响目的：观察波动性高血糖大鼠血管内皮损伤过程中血小板活化及PKCβ1表达情况及赤芍川芎有效部位的干预效应。方法：SD大鼠100只,普通饲料适应性喂养2w后,随机选取10只作为正常对照组(N组)。余下90只大鼠进行高糖高脂饲料喂食,喂食方式采用定时定点投食(每日8：00-9：00、14：00-15：00、20：00-21：00共计三次,每次持续1h)。4w后按30mg/kg剂量一次性经腹腔注射STZ,3d后连续测定模型大鼠空腹和餐后2h血糖,以空腹血糖大于11.1mmol/L且餐后血糖不大于33.3mmol/L作为入选标准,成功纳入符合要求的2型糖尿病大鼠62只。根据大鼠平均血糖和体重将成功纳入的2型糖尿病大鼠分为以下6组：稳定高糖组(W组,11只)：每日定时喂食低GI饲料；波动高糖组(B组,11只)：每日定时喂食高GI饲料；波动高糖+二甲双胍组(MH组,10只)：每日定时喂食高GI饲料,并按150mg/kg/d灌服盐酸二甲双胍混悬液；波动高糖阿司匹林组(ASA组,10只)：每日定时喂食高GI饲料,并按60mg/kg/d灌服阿司匹林肠溶片混悬液；波动高糖+川芎嗪组(TMP组,10只)：每日定时喂食高GI饲料,并按100mg/kg/d灌服盐酸川芎嗪混悬液；波动高糖+芍药苷组(PAE组,10只)：每日定时喂食高GI饲料,并按10mg/kg/d灌服芍药苷混悬液。正常组(N组,10只)：每日定时喂食基础饲料,并灌服等体积蒸馏水。药物干预6w后,所有大鼠禁食12h,腹主动脉采血,部分血液分离血清后用于进行生化检测,部分置于抗凝管中用于血小板蛋白提取和流式细胞术检测。分离大鼠腹主动脉和胸主动脉,取上端2cm,将其固定于20%甲醛中进行切片及苏木素-伊红(H&E)染色用于组织形态学观察,其余部分液氮迅速冻存后置于-80℃冰箱保存,用于主动脉PKCβ1蛋白表达检测。结果：1.主动脉病理结果：与N组相比,W组和B组主动脉组织出现了明显的紊乱、损伤以及早期动脉粥样硬化斑块征象,且B组损伤程度更为严重；与B组相比,TMP组、PAE组、MH组和ASA组大鼠主动脉内皮组织结构及状态均有不同程度改善。2.体重和血清生化指标：与N组相比,W组和B组糖尿病大鼠血清FBG、TC、TG水平均出现明显增高(P<0.01),大鼠体重与insulin水平出现显著降低(P<0.01)；但W组与B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。与B组相比,TMP组、PAE组和MH组大鼠血清FBG、TC、TG水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),同时insulin显著增加(P<0.01),ASA组则无显著变化。3.炎症反应和氧化应激相关指标：与N组相比,W组和B组糖尿病大鼠血清vWF、E-selectin和ROS含量均显著增多(P <0.01), SOD和T-AOC水平显著降低(P<0.05或P<0.01),且B组与W组之间具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。与B组相比,TMP组、PAE组、MH组和ASA组大鼠血清vWF、E-selectin、ROS含量不同程度下降(P<0.05或P<0.01),同时伴有SOD和T-AOC水平明显升高(P<0.05或P<0.01)。4.血小板膜蛋白CD62p水平：与N组相比,W组和B组大鼠血小板膜糖蛋白CD62p水平均显著增加(P<0.01),且B组与W组之间具有显著差异(P<0.05)。与B组相比,TMP组、PAE组、MH组和ASA组大鼠血小板膜蛋白CD62p表达均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。5.血清、血小板及主动脉PKCβ1蛋白表达：与N组相比,W组和B组大鼠血清PKCβ1主动脉及血小板PKCβ1蛋白表达均显著增加(P<0.05或P<0.01),且B组与W组之间具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。与B组相比,TMP组、PAE组和MH组大鼠血清、主动脉和血小板PKCβ1蛋白表达均明显下降(P<0.05或P<0.01)；ASA组大鼠主动脉PKCβ1蛋白表达显著降低(P<0.01),而血清和血小板PKCβ1蛋白表达无显著变化(P>0.05)。结论：赤芍川芎有效部位能够通过显著降低血糖波动2型糖尿病大鼠的炎症反应和氧化应激水平,发挥抗内皮损伤效应；同时能够显著抑制血糖波动状态所致的血小板过度活化,且上述效应与其显著抑制冠心病血瘀证目标分子PKCβ1的过度表达相关。