代谢紊乱是肿瘤细胞区别于正常细胞的显著特征。与正常组织细胞相比,肿瘤细胞及其微环境具有高代谢、乏氧、低p H等特点。本文进行了如下两部分的工作:根据肿瘤细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）失衡的特点,我们使用了原位近红外光控释H2的铑钯氢合金纳米颗粒（RhPd-H nanopaticle,RhPd-H NP）,通过材料在肿瘤部位的特异性蓄积,使用近红外光控释氢气（H2）的方法,实现对肿瘤的有效杀伤,建立了难治性三阴性乳腺癌的氢热治疗新策略,具有安全高效的优点。另一方面,根据肿瘤细胞高代谢特点,我们开发了荧光香豆素探针用于检测肿瘤细胞内源性碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）,通过与ALP特异性结合并产生比率荧光来检测细胞内ALP的水平,反映肿瘤代谢情况,展现了良好的诊断和评估预后能力。第一部分:原位近红外光控释H2的RhPd-H材料用于乳腺癌氢热治疗背景和目的:乳腺癌非手术治疗中常规化疗主要杀伤快速增殖细胞,对消化道上皮、血细胞等也有不同程度的杀伤作用,常规放疗容易引起皮肤损害和放射性肺炎。靶向药物治疗受益人群有限。因此亟需开发新的乳腺癌治疗手段。目前研究发现肿瘤细胞内的氧化还原平衡更容易被破坏,导致肿瘤细胞易因ROS超载而死亡。氢气（H2）作为一种具有较高生物安全性的还原剂,可以有效破坏实体瘤细胞中ROS平衡,具有抗炎和抗肿瘤效果。因此我们开发了一种基于铑钯金属合金储氢纳米颗粒（RhPd-H nanopaticle,RhPd-H NP）的氢-热联合治疗策略,能够实现近红外光触控释放H2,从而与细胞内ROS发生氧化还原反应,利用肿瘤细胞与正常细胞ROS水平和敏感度的差异,选择性杀伤肿瘤细胞。研究方法:1、利用溶剂热法制备储氢纳米材料RhPd-H纳米颗粒,并通过XRD,XPS对产物进行表征,验证氢原子在纳米颗粒中稳定储存。2、通过紫外-可见分光光度法（UV-Vis）和亚甲基蓝实验（methylene blue,MB）评估RhPd-H在808nm激光照射下释放H2的能力。借助热电偶和热成像仪通过体内外实验考察RhPd-H纳米颗粒的光热转化能力,同时探究RhPd-H在动物体内的光声成像能力。3、通过透射电镜和电感耦合等离子体质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）表征考察RhPd-H能否被肿瘤细胞摄取,通过细胞毒性实验考察RhPd-H的安全性以及对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤情况。4、建立4T1三阴性乳腺癌荷瘤小鼠模型,探究基于RhPd-H的氢热治疗策略的体内治疗效果,并且通过血生化检测和组织器官切片染色证明RhPd-H的生物安全性。5、通过ROS探针探究RhPd-H材料在细胞内发挥作用的机制,进一步探讨氢热治疗肿瘤策略的临床应用潜力。研究结果:1、H2以原型储存在铑钯金属合金结构中,RhPd-H材料具有稳定的结构和高度近红外光可控H2释放性能。2、通过亚甲基蓝在664 nm特征性吸收峰计算RhPd-H的H2释放曲线,结果显示,在808 nm近红外光照射下,RhPd-H可以持续稳定释放H2,并且RhPd-H在1W/cm~2的功率密度照射下5 min升温超过60℃。此外,通过光声成像发现RhPd-H可在荷瘤小鼠体内6 h左右到达肿瘤位置蓄积,并持续稳定滞留超过24 h,说明RhPd-H能够有效蓄积在肿瘤部位。3、电镜和ICP结果显示RhPd-H可以被肿瘤细胞有效摄取。RhPd-H借助近红外控释H2可以还原细胞内的MB并有效杀伤细胞,与正常乳腺上皮细胞对比,RhPd-H氢热治疗策略对乳腺肿瘤细胞的杀伤效果显著,而对正常细胞几乎没有影响。4、RhPd-H基氢热治疗策略用于4T1荷瘤小鼠的治疗结果显示,肿瘤体积明显缩小,并且没有明显全身毒副作用。肿瘤免疫组化切片显示肿瘤细胞Ki67细胞增殖标志物明显减少,说明肿瘤细胞生长受到抑制。其他组织器官H＆E染色和血生化结果表明RhPd-H没有全身毒性。5、ROS探针实验结果证明RhPd-H释放的H2可以中和细胞内的ROS,并且最终使得肿瘤细胞内的ROS水平明显提高从而起到杀伤作用。而不含氢的RhPd则没有这种效果。肿瘤治疗后的碱性磷酸酶（ALP）水平明显下降,提示细胞内ALP水平可能与肿瘤生长状态有关。研究结论:1、RhPd-H是一种具有良好升温能力的储氢纳米颗粒,具有光声成像,通过近红外光能够可控调节释放H2,并且发挥H2的生物还原性,可进一步加重肿瘤代谢失衡。2、RhPd-H可以在肿瘤部位蓄积并进入细胞内部,从而有效杀伤肿瘤细胞。但这种过程对正常细胞影响很小,体现了其良好的生物安全性。3、体内实验结果证实RhPd-H基氢热治疗策略不仅具有明显的抑瘤作用,而且能保护正常细胞免受高温损害,是一种安全高效的协同治疗模式;H2通过破坏肿瘤细胞内ROS平衡而导致ROS异常升高而杀伤细胞;光热治疗后肿瘤组织碱性磷酸酶水平明显下降,提示肿瘤生长状态和酶活性密切相关。综上所述,我们通过制备稳定、高氢存储、光控释氢和光热转换性质的多功能RhPd-H纳米颗粒,实现靶向肿瘤的高效递氢和光热转换,激活ROS选择性杀伤肿瘤细胞,建立了安全、高效的氢热协同抑瘤新模式,在肿瘤治疗领域具有潜在的应用价值。第二部分:香豆素荧光探针对内源性碱性磷酸酶活性的检测和肿瘤成像背景和目的:ALP是一种广泛存在于人体各种组织细胞中的酶,它在许多细胞功能的调节过程中起着重要作用。而ALP在肿瘤细胞和正常细胞中的含量有明显区别,同时在不同肿瘤内的水平也大不相同,提示通过检测细胞内ALP水平有助于区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞,实现对肿瘤的诊断。香豆素荧光染料具有良好的双光子特性和大的斯托克斯位移,因此以香豆素及其衍生物为母体开发的荧光探针非常适合用于生物医学领域的检测。基于以上研究背景,基于荧光香豆素中受磷酸基团保护的羟基给电子基团,我们设计了一种基于有机小分子的比率型荧光探针（fluorescent probe,FCP）,用于特异性检测ALP,展示出较强的抗干扰能力,并且能够有效区分不同细胞内源性ALP的活性。研究方法:1、合成荧光香豆素（fluorescein-coumarin,FC）和荧光香豆素比率探针（fluorescent probe,FCP）,并通过电喷雾质谱法（ESI-MS）和核磁共振技术检测对探针进行表征,初步研究FCP探针与ALP特异性结合的机制,为进一步检测提供理论依据。2、利用UV-Vis考察在体外环境中探究FCP比率荧光探针与ALP反应后的光谱变化,获得FCP反应前后双峰比率与ALP浓度的关系。同时通过检测人血清样品中ALP,验证其检测水平。3、在不同pH、反应时间的条件下评估FCP检测ALP能力的稳定性,并且与非目标分析物混合来模拟不同干扰环境下FCP检测的特异性和抗干扰能力。4、通过理论计算分析研究FCP比率荧光检测的原理和机制,并阐明荧光信号的来源,明确检测过程的反应变化。5、培养人传代肝癌细胞系和人传代正常肝细胞系,利用FCP检测恶性肿瘤细胞内ALP并分析其诊断能力,同时通过细胞毒性实验证明了FCP探针的生物安全性。研究结果:1、ESI-MS和核磁共振结果显示,FCP分子上具有一个磷酸基团,可以和ALP特异性结合反应,并生成FC。2、UV-Vis结果表明FCP与ALP反应后在450 nm处产生吸收峰,并伴随溶液颜色变化。在320nm激发光下,荧光香豆素结构在465 nm处有荧光发射峰,并随着ALP浓度的升高而不断减弱,同时在530 nm处出现新的荧光发射峰。荧光强度比率I530/I465在一定范围内与ALP浓度成线性关系,LOD为0.006 m U/m L。3、随着反应体系p H值升高,FCP的I530/I465不断增加,检测范围为5＜p H＜10,最适p H=8.0;FCP和ALP可以快速反应,并且在15 min后达到稳定。在与不同物质混合检测结果显示,FCP与ALP反应检测值远远超出对照干扰物质,证明了其检测特异性。4、通过DFT/TDDFT计算结果可知,FCP检测荧光信号来自π共轭的荧光香豆素基团,并且分子对接计算证明FCP、FC与ALP可以牢固结合。5、FCP在Hep G2肝癌细胞中的荧光信号显著高于正常人肝细胞系LO2,高浓度FCP探针（50μM）与上述2种细胞孵育24h没有表现出明显毒性。用ALP清除剂提前清除Hep G2肝癌细胞系和正常人肝细胞系LO2内的ALP后,细胞内荧光信号明显减弱。研究结论:1、FCP是一种特异性结合ALP的比率型荧光探针。2、FCP具有良好的适应性,适应p H值范围大,检测时间短,并且可以避免其他物质的干扰。3、FCP探针能够区分良恶性肿瘤细胞内的ALP活性差异,为临床诊断提供理论依据和实验基础。