【摘 要】
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该研究在原有构建的抗CD71 ScFv表达载体pUC19/119基础上,设计一对引物,5端引入HindⅢ酶切位点,3端引入Xba Ⅰ酶切位点.采用PCR方法,扩增出ScFv基因.并将其与T载体相连.转化
【出 处】
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华中科技大学同济医学院 华中科技大学
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该研究在原有构建的抗CD71 ScFv表达载体pUC19/119基础上,设计一对引物,5端引入HindⅢ酶切位点,3端引入Xba Ⅰ酶切位点.采用PCR方法,扩增出ScFv基因.并将其与T载体相连.转化大肠杆菌,阳性菌进行序列测定.结果所扩增的ScFv与原McAb基因相比序列组成基本吻合.将ScFv-pGEM-T和含有PE毒素的表达载体pSW202(含有HindⅢ,XbaⅠ两个酶切位点),用HindⅢ和Xba Ⅰ进行双酶切.挑取2株阳性菌经IPTG诱导,诱导细菌经超声破碎及尿素等处理,对表达产物进行初步纯化.对初步纯化的融合蛋白进行体外效应研究,经间接免疫荧光法与细胞ELISA示检测,此融合蛋白能与表面表达CD71受体的细胞特异性结合,而不与CD71受体阳性的细胞发生反应.细胞ELISA竞争抑制法显示,此融合蛋白能阻止McAb与CD71受体结合,且随融合蛋白浓度升高,其抑制作用越强.MTT法检测重组毒素的细胞毒作用,结果显示,此融合蛋白对表面CD71受全阳性的细胞具有明显的杀伤活性.说明所构建的融合蛋白具有特异性细胞毒作用.
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