sytI分子特性分析与miRNA对丝蛋白调控

来源 :浙江大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:shijianwu2003
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Synaptotagmins(syt)是膜转运蛋白中的一个家族,它广泛存在与生物神经系统中,它含有两个钙结合区:C2A和C2B,通过调控Ca2+内流以诱导突触囊泡发生胞吐而引起神经递质释放。本文就sytⅠ的分子特性如影响RNA编辑的发生、C2结构域的组织特征等做一阐述。RNA编辑是生物体调节生物功能的一个重要机制。我们意外发现果蝇sytⅠ转录本中发生编辑的外显子具有较低的GC、GC3含量及较高的Gibbs自由能,系统分析果蝇的其它47个已实验验证的编辑外显子发现这种趋势同样存在。序列比队、Ks和Ka/Ks分析结果显示编辑的外显子经受了更大的纯化选择,这种选择压力可以抑制核苷改变,这与进化中相同特性的外显子所经受的潜在核苷置换率相矛盾。编辑外显子的这种特异分子特性或组成(如较低的GC含量)等很可能是除双链RNA(dsRNA)外另一个指引RNA编辑发生的必备条件。这样,DNA分子特性、RNA编辑和纯化选择三者之间可能会存在某种联系。通过突变sytⅠ外显子GC含量等实验进一步证明DNA分子特性的改变如GC含量的增加或降低可以明显地影响编辑位点的编辑效率,这或许与分子活跃性有关。sytⅠ的另一个分子特性是它含有保守的C2结构域,为了进一步研究其在生物进化中的作用,我们分别在拟南芥、线虫、果蝇和人类基因组鉴定了104,44,44和142个基因,它们分别含有154,65,63和218个C2结构域。系统发生分析表明这些基因大致可分为28个组,但是动物和植物C2结构域间并没有发现相似性,这可能说明了C2结构域在这两个真核种系的独立起源。同一进化分枝内外显子/内含子组织结构的保守性进一步支持了它们之间进化的相互关系。内含子相的非均匀性分布表明这些C2结构域在进化过程中受到特定的选择。我们发现内含子丢失不仅发生在编码序列的3’端,而且也发生在其它区域,这可能与不同的内含子丢失机制相关。microRNA是一类小分子非编码性RNA,它在基因表达调控中发挥重要角色。尽管国际贸易中丝绸是最重要的织品及原料之一,但是关于家蚕miRNA及其靶点鉴定方面的研究报道甚少。本文中,我们从家蚕基因组中鉴定了41个miRNA,它们分属于37个家族,并且我们对随机抽取的25个miRNA做表达分析,结果证实其可靠性。另外还描述了家蚕miRNA的一些特性,如位置特异性核苷分布、进化保守性与串联组织分布等等。另外我们又在家蚕基因组中鉴定了129个miRNA潜在靶位点。GO分子功能分析表明这些靶基因绝大部分具有结合、酶、转录调节等活性,这可能于miRNA参与各种重要的生物过程如发育、细胞增殖、分化、细胞凋亡、代谢调节等有关。我们也发现至少有四种miRNA(miR-33/-190/-276/-7)潜在结合到蚕丝蛋白的3’UTR区,这或许表明miRNA在蚕丝发育中扮演重要角色。接下来我们克隆了家蚕丝蛋白3’UTR区,并且对其中的两个miRNA结合位点进行了突变,把它们连接到报告基因GUS后面构建了四种表达载体。对相应的miRNA我们也构建了不同的表达载体。通过农杆菌渗透实验共表达分析,GUS染色、RT-PCR、GUS酶活测定结果表明所预测的miRNA(33-miR/7-miR)均能调控蚕丝蛋白基因的表达,并且这种调控是以miRNA与靶位点互补性结合为基础的。研究还发现人工合成的miRNA同样也能起到调控靶基因表达的目的。另外,与通常所用的细胞转化或稳定转基因相比,叶片瞬时表达体系是一种高效简便的方法,它可以广泛应用与各种动植物miRNA调控研究中。
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