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目的：通过分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞(human umbilical cord stromal-derived mesenchymal stem cells, hUCS-MSCs);并将其在体外与肝癌细胞共培养,初步研究肝癌细胞共培养微环境条件下人脐带间充质干细胞的分化情况及脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖的影响。方法：1.人脐带间充质干细胞的分离、培养。采用贴壁法,从脐带中分离培养间充质干细胞,无菌收集脐带,在超净台上剪取约2cm长的脐带,剖开动静脉,用PBS洗净血污；将脐带剪碎成肉糜状,转移到离心管中,加入4ml的消化液,混匀,37℃中消化1小时,每隔10分钟振摇一次；吸取消化上清,稀释离心收集细胞,转移到T25cm2细胞培养瓶中,加入L-DMEM培养基(含10%胎牛血清),37℃、5%C02孵箱培养,期间勿摇晃；第三天半量换液,第七天全量换液,待细胞生长至80%融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代,备用。2.流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面标志分子的表达。取第四代扩增后细胞培养瓶中的hUCS-MSCs样细胞,用0.25%胰蛋白酶液37℃、3min进行消化细胞,离心,收集细胞。PBS洗涤后制成浓度为2×105/500μL每管的单细胞悬液,并做标记,每管中分别加入抗人CD34-FITC, CD29-PE, CD105-AP单抗各21μL及加入抗鼠IgG1-FITC单抗各10l,室温孵育30min,进行流式细胞仪检测。3.人脐带间充质干细胞与肝癌细胞体外共培养,观察人脐带间充质干细胞的分化情况及脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖的影响。用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction RT-PCR)检测肝细胞和肝癌细胞标志分子的表达：分别于第7、14、21天检测经共培养后hUCS-MSCs细胞AFP mRNA、ALB mRNA、CK19mRNA的表达。用糖原染色检测肝细胞功功能：分别于第7、14、21天检测hUCS-MSCs田胞经共培养后糖原染色情况。利用MTT法检测hUCS-MSCs细胞与Hep3B细胞共培养后Hep3B细胞的增殖情况。结果：1.从人脐带中可分离得到贴壁生长的间充质干细胞,其中CD29+田胞比例为96.02%, CD105+田胞比例为96.6%,CD34-细胞比例为99.65%,CD105+CD29+双阳性细胞比例为94.84%。2.共培养第7天Hep3B实验组及LO2对照组仅有AFP mRNA阳性表达；第14天时Hep3B实验组表达CK19mRNA, LO2组表达ALB mRNA;第21天时,Hep3B与hUCS-MSCs共培养实验组AFP mRNA、CK19mRNA呈持续阳性表达,而LO2与hUCS-MSCs共培养对照组ALB mRNA呈阳性表达、AFP mRNA未出现表达；阴性对照组在上述时间点均未检测到阳性表达。糖原染色在Hep3B实验组及L02对照组共培养21天呈阳性,即部分细胞可检测到糖原染色阳性细胞(胞浆呈桃红色)；第7、14天及阴性对照组细胞胞浆糖原染色均呈阴性。3.hUCS-MSCs与Hep3B共培养能够抑制Hep3B的增殖,而且随着hUCS-MSCs数量的增加和处理时间的增加,抑制率增加。在24h、48h和72h时,hUCS-MSCs:Hep3B=10:1与hUCS-MSCs:Hep3B=5:1组Hep3B细胞的增殖能力减弱,与对照组具有显著差异(P<0.01)；hUCS-MSCs:Hep3B=1:1组Hep3B细胞的增殖能力减弱,与对照组具有显著差异(P<0.05); hUCS-MSCs:Hep3B=1:5组Hep3B细胞增殖能力与对照组相比没有明显差异(P>0.05)。结论：1.利用双酶消化法分离、扩增的细胞并经流式细胞仪行间充质干细胞标志分子鉴定后,成功分离从脐带间充质干细胞,并用于体外培养。2.人脐带间充质干细胞与人肝癌细胞Hep3B体外共培养条件下,脐带间充质干细胞可能向未成熟肝样细胞方向分化。3.人脐带间充质干细胞与正常人肝细胞L02体外共培养条件下,脐带间充质干细胞可能向成熟肝样细胞(肝细胞样细胞)方向分化。4.肝癌细胞与人脐带间充质干细胞体外直接共培养条件下,肝癌细胞的增殖受到明显抑制。