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青蒿是我国传统中药材,基源植物为菊科植物黄花蒿(Artemisia annua L.),本论文统称其为青蒿。其产生的次生代谢产物青蒿素,是含有过氧化桥结构的倍半萜内酯化合物,对于抗氯喹型疟疾和脑型疟疾具有非常显著的疗效。世界卫生组织(the World Health Organization,WHO)推荐以青蒿素为基础的联合疗法为治疗疟疾的首选方法。由于青蒿素主要是从青蒿植株中提取,因此以青蒿为研究材料开展青蒿素的生物合成及其调控的分子机制研究是次生代谢研究领域的一个热点。植物次生代谢产物的生物合成往往受到激素诱导。多个研究团队发现使用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)处理可以显著提高青蒿素生物合成基因的表达和青蒿素含量。随后,研究人员分别从青蒿中克隆了一系列受到MeJA诱导的转录因子,如AaWRKY1、AaORA、AabHLH1、AaERF1、AaMYC2、AaHD1和AaGSW1等。但最近对真核生物转录起始的分子机制研究表明转录因子在起始转录的过程中,不能直接与RNA聚合酶II结合,需要中介体作为中间桥梁连接转录因子与RNA聚合酶Ⅱ,并招募通用转录因子形成转录起始复合物。对拟南芥中介体的研究显示,中介体亚基AtMED25能够与多个茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号通路中的转录因子相互作用,从而调控这些转录因子对靶标基因的转录激活活性。为了进一步深入解析青蒿素生物合成的分子调控机制,本研究基于全基因组分析筛选到候选青蒿中介体亚基AaMED25,证明AaMED25结合青蒿JA信号通路中的重要转录因子AaMYC2并激活AaMYC2对青蒿素生物合成基因的转录激活活性,从而提高了青蒿素生物合成能力。具体研究结果如下:1.基于全基因组分析筛选到候选中介体亚基AaMED25利用HMMER和BLASTP程序对青蒿基因组进行扫描发现,青蒿具有6个MED25的同源基因。随后,根据公开发表的18个青蒿各组织部位转录组数据库对候选AaMED25进行表达分析。分析结果表明青蒿组中的6个MED25候选基因中,仅有一个在主要的青蒿素生物合成部位—青蒿分泌性腺毛体中表达。因此,本研究以该基因为最终候选基因,命名为AaMED25。2.AaMED25与转录因子AaMYC2相互作用并增强AaMYC2的转录激活活性利用荧光定量PCR对AaMED25在青蒿各组织部位的相对表达水平分析发现,AaMED25在青蒿中组成型表达,并且在青蒿叶和花蕾中的表达水平显著性高于其在茎的表达水平,这与青蒿素生物合成关键酶基因的表达模式一致。诱导表达分析表明,AaMED25的表达受到MeJA的强烈诱导,在MeJA处理后,AaMED25的表达量与对照组相比提高9倍。此外,AaMED25基因的表达还受到低温诱导,4℃处理青蒿植株后,基因表达量与对照组相比提高1.7倍。随后,酵母双杂交筛选发现,AaMED25与青蒿JA信号转导通路中重要的转录因子AaMYC2之间存在相互作用;进一步对AaMED25功能结构域的研究发现,只有当AaMED25蛋白中的中间结构域和激活子相互作用结构域共同存在时,AaMED25与AaMYC2才会发生互作。最后,双荧光素酶分析试验表明,AaMED25能够增强AaMYC2对青蒿素生物合成关键酶基因的转录激活活性,从而调控青蒿素的生物合成。3.过表达AaMED25提高青蒿素含量为了在体内研究AaMED25基因对青蒿素生物合成的影响,本研究通过农杆菌介导的遗传转化获得了过表达AaMED25的转基因青蒿。在过表达AaMED25的转基因青蒿中,实时荧光定量PCR分析显示,AaMED25的表达水平是对照组的3-4倍,并且青蒿素生物合成关键酶基因的表达得到显著性提高。利用HPLC检测过表达AaMED25转基因青蒿中的青蒿素含量,结果显示转基因青蒿中青蒿素的含量为8.06-11.4 mg/g(DW),同时期对照组青蒿中的青蒿素含量为6.48 mg/g(DW)。与对照组相比,转基因青蒿中青蒿素含量提高1.3-1.7倍。