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水牛奶营养价值高,富含钙,能值高,奶品质好。中国水牛的数量资源极其丰富,但水牛奶业的起步较晚,并且奶业的地域发展不平衡,因此,开发水牛奶业具有重大意义。而牛乳中含量丰富的的αs1-酪蛋白在人乳中并不存在,同时也是人摄入牛奶时重要的过敏原。本研究选取与αs1-酪蛋白表达密切相关的CSN1S1基因和与产奶量密切相关的DGAT1基因,通过多位点基因打靶技术结合Cas9体外人工内切酶对在水牛胎儿肾脏成纤维细胞对CSN1S1基因和DGAT1基因进行靶向操作。首先,由公司针对CSN1S1基因的CDS序列设计三个RNAi靶位点,分别构建shRNA瞬时表达质粒pGPU6-shRNA-NEO-1,pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3和阴性对照pGPU6-shRNA-NEO–NC。然后通过EGFP真核表达载体pEGFP-N1和pEGFP-C2融合CSN1S1基因,构建质粒pEGFP-N1-CSN1S1和pEGFP-C2-CSN1S1。将shRNA瞬时表达质粒和绿色荧光融合表达质粒共转染293T细胞,电子显微镜下观察绿色荧光的表达情况。结果表明,三组shRNA瞬时表达质粒均可有效抑制绿色荧光的表达,其中pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3的效果要稍好于pGPU6-shRNA-NEO-1。后提取转染后细胞的总RNA,经过逆转录后用CSN1S1基因特异引物做半定量PCR,进行灰度分析,结果也同时证明了三个靶点均有效,但三组shRNA表达质粒对CSN1S1的干扰效果没有显著差异。然后,选择shRNA瞬时表达质粒pGPU6-shRNA-NEO-2,pGPU6-shRNA-NEO-3质粒作为模板,设计引物并扩增U6-shRNA-NEO片段,将其克隆到打靶载体骨架P UC19-HRDS1-HRDS2上面,进而构建针对CSN1S1基因的多位点打靶质粒PUC19-H RDS1-U6-shRNA-NEO-HRDS2-1和PUC19-HRDS1-U6-shRNA-NEO-HRDS2-2。接着,由公司构建DGAT1基因打靶质粒PUC19-HRDS1-SV40-DGAT1-ZEO-pA-HRDS2。将打靶质粒与Cas9表达质粒共转染水牛胎儿牛肾成纤维细胞,设置三个对照组,分别是打靶质粒单独转染组,打靶质粒和Cas9表达质粒共转染组,未经转染空细胞组,72h后分别提取每组细胞的基因组DNA,设计引物检测基因的整合。结果表明,打靶质粒单独转染组,打靶质粒和Cas9表达质粒共转染组均检测到了基因的整合,空细胞组没有基因的整合。之后设计定点整合引物,用提取的细胞基因组做模板,均未检测到基因的定点整合。