论文部分内容阅读
目的1.赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)的相互作用蛋白的验证,明确蛋白相互作用位点。2.探讨LOX和XRCC5蛋白相互作用对乳腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响。方法1.在乳腺癌MDA-MB-231细胞转染重组蛋白LOX-SF的慢病毒,通过western blot和RT-PCR对细胞中重组蛋白LOX-SF进行检测。2.采用双向免疫共沉淀,免疫荧光共定位的实验方法验证LOX与XRCC5和Histone H1.1的相互作用。3.我们采用慢病毒作为载体的过表达技术,分别构建稳定过表达LOX、过表达XRCC5的载体,单独转染和联合转染至低转移潜能并且LOX低表达的MCF-7细胞中,分为未转染组、LOX空载体组、LOX转染组、XRCC5空载体组,XRCC5转染组、LOX和XRCC5空载体共转染组及LOX和XRCC5过表达共转染组;流式分选联合转染LOX和XRCC5过表达载体及空载体共转染的细胞株,western blot和RT-PCR检测转染后各组细胞的LOX和XRCC5蛋白表达的变化,分别通过Transwell迁移和侵袭实验检测转染细胞的迁移与侵袭能力。结果1.在MOI=10的条件下,LOX慢病毒转染MDA-MB-231细胞,96 h后镜下观察绿色荧光间接评估慢病毒转染效率,发现慢病毒转染效率>90%。Western blot结果显示：实验组能检测到重组蛋白LOX-SF和LOX本体蛋白,而空白对照组和阴性对照组未能检测到重组蛋白LOX-SF的条带,仅都能检测到LOX本体蛋白。RT-PCR结果：实验组、空载对照组及空白对照组重组基因LOX mRNA的2““‘值分别为15.32±0.12、1.18±0.01、1.00±0.00,实验组LOX-SF mRNA表达水平明显高于空载对照组和空白对照组(P<0.01),空载对照组和空白对照组LOX-SF mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。2.免疫共沉淀(Co-IP)结果表明,Western blot能检测到LOX抗体沉淀的免疫复合物中含有XRCC5、Histone H1.1蛋白,且免疫印迹中出现的条带与MDA-MB-231细胞总蛋白的条带位置一致。3.反向免疫共沉淀结果表明：Western blot能分别检测到XRCC5抗体、Histone H1.1抗体沉淀的免疫复合物中含有LOX蛋白,且免疫印迹中出现的条带与MDA-MB-231细胞总蛋白中的LOX蛋白条带位置一致。4.实验采取内源性共定位分析(即未经任何处理的MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞)进行。分别用不同种属的抗体进行免疫荧光定位分析,用激光共聚焦显微镜扫描(630×)可见,LOX与Histone H1.1共定位分析：LOX红光标记,主要定位在胞质,少部分在胞核,呈弥散分布；Histone H1.1绿光标记,主要定位在胞质,LOX与Histone H1.1在胞质存在明显共定位,呈现黄色。LOX与XRCC5共定位分析：LOX绿光标记,主要定位在胞质及细胞核,呈弥散分布；XRCC5红光标记,定位在细胞核内,也呈弥散分布；LOX和XRCC5在细胞核存在明显的共定位,呈现黄色。5.在MOI=10条件下,将LOX和XRCC5过表达慢病毒载体联合转染乳腺癌MCF-7细胞后,对LOX和XRCC5过表达共转染组及LOX和XRCC5空载体共转染组细胞进行流式荧光分选,通过流式荧光检测LOX和XRCC5空载体共转染组筛选出的细胞转染效率由15.37%提高到83.94%,LOX和XRCC5过表达共转染组的细胞流式荧光检测,转染效率由45.65%提高到70.82%。6.采用Western blot及Real-time PCR分别检测转染后各组LOX和XRCC5在基因和蛋白水平的变化。Western blot结果能检测到LOX蛋白在MCF-7有表达且为低表达；实验组能检测到重组蛋白LOX-SF和LOX本体蛋白,而空白对照组和阴性对照组未能检测到重组蛋白LOX-SF的条带,仅都能检测到LOX本体蛋白。与未转染组及空载体组比较,XRCC5过表达组的XRCC5蛋白表达明显升高。与空白对照组及阴性对照组比较,LOX和XRCC5过表达共转染的细胞LOX和XRCC5蛋白表达量均明显升高。Real-time PCR结果显示：LOX过表达组、LOX空载体组、LOX和XRCC5过表达共转染组、LOX和XRCC5空载体共转染组及未转染组的LOX mRNA的2-ΔΔct值分别为241.044±45.81、2.86+0.41、207.12±±23.40、2.06±0.06、1.00±0.00,LOX过表达组、LOX和XRCC5过表达共转染组的LOX mRNA表达水平明显高于空载体组和未转染组(P<0.01),空载体组和未转染组的LOX mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。XRCC5过表达组、XRCC5空载体组、LOX和XRCC5过表达共转染组、LOX和XRCC5空载体共转染组及未转染组的XRCC5 mRNA的2-ΔΔct值分别为6.57±0.85、1.10±0.27、4.29±0.05、0.76±0.15、1.00±0.00。XRCC5过表达组、LOX和XRCC5过表达共转染组的XRCC5 mRNA表达水平明显高于空载体组和未转染组(P<0.05),空载体组和未转染组的XRCC5 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。7.Transwell迁移实验观察迁移细胞数目,相对于空载体组(71.67±3.51),LOX过表达组(358.67+18.58)、XRCC5过表达组(200.67+11.02)及LOX和XRCC5过表达共转染组(513.33±15.28)的细胞迁移能力均明显增强(P<0.05)。LOX和XRCC5过表达共转染组穿过细胞数最多,与单独转染组即LOX过表达组和XRCC5过表达组比较,差异显著(P<0.05),细胞的迁移能力明显增强。8.Transwell侵袭实验观察侵袭细胞数目,LOX过表达组(97.00±7.55)、XRCC5过表达组(74.33+6.66)及LOX和XRCC5过表达共转染组(140.00±24.98)的细胞侵袭能力均比空载体组(14.67±4.73)的明显增强(P<0.05),且LOX和XRCC5过表达共转染组细胞的侵袭能力明显强于LOX过表达组和XRCC5过表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.LOX与XRCC5存在直接或间接相互作用。2.LOX与Histone H1.1存在直接或间接相互作用。3.在MCF-7细胞中,上调LOX和XRCC5的表达可以增强细胞的迁移、侵袭能力,且两者的联合转染能进一步促进MCF-7细胞的迁移和侵袭能力。LOX和XRCC5相互作用可能协同促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。