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目的:严重烧伤引发的失控性炎症反应是导致多器官功能衰竭及死亡的重要原因之一。目前认为失控性炎症反应主要是由于体内促/抗炎性细胞因子分泌失调所致。巨噬细胞作为炎性细胞代表,分泌大量促/抗炎性细胞因子。近年来研究发现胰岛素可通过调节促/抗炎性细胞因子水平,缓解烧伤后的过度炎症反应。因此,研究胰岛素对烧伤后巨噬细胞分泌炎性细胞因子功能调节作用及其细胞内信号转导机制,对于明确胰岛素发挥抗炎作用机制尤为重要。本研究拟在严重烧伤大鼠模型上,观察不同剂量胰岛素干预对严重烫伤大鼠早期血清IL-1β及IL-10的影响,以及胰岛素对肝脏氧自由基损伤的保护作用;同时在细胞水平对胰岛素信号通路上关键分子PI3K-Akt进行检测分析,观察巨噬细胞TNF-α、IL-1β及IL-10表达情况,同时对IκB、NF-κB的含量及活性进行检测,初步明确胰岛素调控烧伤后巨噬细胞功能失调的细胞内信号转导机制。为临床中应用胰岛素控制严重烧伤后失控性炎症反应,提高救治成功率提供可靠的实验数据及理论依据。方法:1.雄性SD大鼠63只,180~220g,自由进食、水。随机分为烧伤后生理盐水治疗(A)组、生理盐水+胰岛素治疗(分别给于1 IU/kg、3 IU/kg、5 IU/kg胰岛素,B1～B3)组,每组14只,按照6 h、12 h,每个时间点7只。另外7只大鼠作为正常(N)组。伤后6 h、24 h后分别检测血糖、血压及血清IL-1β及IL-10含量。2.在筛选出最佳剂量的基础上,按照正常组、烫伤+盐水组、烫伤+胰岛素组分别增加12 h、48 h时间点,每个时间点7只大鼠。伤后6,12,24,48h对肝脏总抗氧化能力(T-AOC)、超氧歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)进行检测,同时检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平,病理切片观察肝细胞形态学改变。3.培养人单核巨噬细胞系U937细胞在1640培养基中,分组如下:A. 10%正常大鼠血清B. 10%正常大鼠血清+10U/L胰岛素C. 10%正常大鼠血清+10U/L胰岛素+ LY-294002D. 10%烫伤大鼠血清E. 10%烫伤大鼠血清+10U/L胰岛素F. 10%烫伤大鼠血清+10U/L胰岛素+ LY-294002在6,24 h不同时间点分别收集细胞提取浆蛋白、核蛋白,用于检测p-Akt、IκB及NF-κB;收集24 h上清液,用于TNF-α、IL-1β及IL-10蛋白检测。结果:1.伤后大鼠血糖明显升高,6 h达到(10.72±1.76)mmol/L,并持续高血糖状态。3 IU/kg胰岛素6 h血糖(5.97±0.76)mmol/L,与正常值(5.13±0.62)mmol/L比较无统计学差异(P > 0.05);伤后6 h、24 h血压均明显低于正常值,3 IU/kg胰岛素对伤后血压有显著改善作用。烫伤后血清IL-1β显著升高,不同剂量胰岛素干预均可降低IL-1β水平(P < 0.05或P < 0.01),3 IU/kg时血清IL-1β在6 h、24 h分别为(54.04±8.64)ng/L及(46.83±6.77)ng/L。烫伤后血清IL-10含量呈现升高变化,胰岛素可提高烫伤大鼠血清IL-10含量,以3 IU/kg伤后24 h最为明显,达到(45.46±5.20)ng/L,与单纯盐水治疗组相比差异非常显著(P < 0.01)。2.伤后6h盐水组肝脏中T-AOC、SOD较正常组明显降低,而ROS明显升高(P < 0.05),并随时间延长变化更加明显。ICAM-1及血清ALT在12,24,48 h均较正常组明显增高(P < 0.01)。伤后24 h胰岛素组肝脏T-AOC、SOD分别为(386.5±75.1)U/g及(210.0±38.6)U/g,较盐水组肝脏明显提高(P < 0.01),而ROS为(154.3±28.6)U/g,较盐水组明显降低(P < 0.01)。同时胰岛素组肝脏ICAM-1及血清ALT水平明显降低,48 h结果分别为(244.8±54.4)mmol/L及(78.9±15.8)ng/L(P < 0.01)。病理切片显示烫伤后胰岛素可减轻肝细胞损伤程度。3.胰岛素作用于正常巨噬细胞后,Western Blotting结果显示,p-Akt明显增高,而核内NF-κB同时增高,ELISA结果显示,TNF-α、IL-1β含量明显增高,而IL-10则降低。当巨噬细胞经过烧伤血清激活后,p-Akt含量明显降低,而NF-κB活化、TNF-α、IL-1β分泌明显增高,IL-10减少;胰岛素干预后,p-Akt增多,NF-κB活化受到明显抑制,TNF-α、IL-1β分泌减少,IL-10增加,同时PI3K阻断剂LY-294002干预后,胰岛素作用受到抑制。结论:严重烧伤早期大鼠血糖明显升高,胰岛素可以降低伤后血糖,并随剂量的增大作用增强。强化胰岛素干预可调节血清促炎/抗炎性细胞因子水平,减轻伤后机体的炎症反应,当血糖控制在正常范围时其作用最为明显。可增强肝脏抗氧化损伤作用,对早期肝脏损伤具有保护作用。当巨噬细胞被烧伤血清刺激活化后,胰岛素可通过激活PI3K-Akt通路来抑制NF-κB转位效应,降低单核/巨噬细胞的进一步活化,减少炎性细胞因子的分泌。而胰岛素对严重烧伤后炎性细胞因子分泌的调控作用有可能是通过PI3K-Akt通路来实现的。