拟南芥蛋白酶体活性调控蛋白PTRE1功能机制的研究

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26S蛋白酶体在真核生物蛋白降解过程中发挥重要作用,其活性对于生命体的正常生长至关重要,目前对蛋白酶体活性调控的研究报道很少。拟南芥PTRE1 (Proteasome Regulator1)是动物蛋白酶体活性调控蛋白PI31的同源蛋白,参与拟南芥蛋白酶体活性调控和生长素信号通路;PTRE1功能缺失突变体ptre1表现出严重的生长发育的缺陷,此外,对多种非生物胁迫如高温、盐等表现敏感。为了进一步研究PTRE1调控蛋白酶体活性及激素信号、抗逆反应等方面的机制,本研究通过EMS诱变,筛选ptre1表型回复的株系,定位回复子基因,开展功能研究;同时利用酵母双杂交文库筛选PTRE1互作蛋白并对其调控PTRE1的功能和机制开展研究。  通过对ptre1种子进行EMS诱变,对M2代材料的生长进行观察并根据植株的整体长势、叶片大小及卷曲、果荚长度等方面的回复情况,筛选获得了9个独立的回复株系,分别命名为sopt1-9 (suppressor of ptre1)。对26S蛋白酶体活性测定的结果表明9个回复株系的蛋白酶体活性较ptre1突变体均有不同程度的提高;体外ABA、NaCl处理统计种子的萌发率,回复株系也均有不同程度的提高。将显性株系sopt1与ptre1杂交,选取F2代材料进行全基因组测序、数据分析,获得了sopt1突变位点的候选基因。通过对候选基因进行验证,发现26S蛋白酶体α5亚基PAE1的突变位点与表型完全连锁。PAE1在拟南芥中有一个高度同源的基因PAE2,在获得pae1、pae2突变体的基础上,我们进一步将pae1、pae2分别与ptre1杂交,发现F2代基因型为ptre1 pae1、ptre1 pae2、ptre1 PAE1/pae1、ptre1 PAE2/pae2的植株表现出了生长回复的表型。26S蛋白酶体活性检测发现ptre1 pae1、ptre1 pae的活性较ptre1明显提高。PAE1(Δ)突变转录本的翻译蛋白在烟草细胞质内的定位明显减弱及蛋白稳定性下降。这些结果说明sopt1中ptre1的表型回复是因为突变后的PAE1基因产生的蛋白不稳定,最终导致类似PAE1缺失的结果。此外,观察发现PAE1和PAE2也参与了胚胎发育的调控。  通过酵母双杂交筛选,获得了PTRE1的互作蛋白RbohF。已有研究表明RbohF催化NADPH转化为NADP,同时将电子转移给膜外的分子氧,最终形成H2O2,参与了众多生理过程特别是逆境胁迫响应的调控。研究发现,缺失突变体rbohF1没有明显的生长发育方面的缺陷,而rbohF1 ptre1双突变体表现出ptre1的表型,表明PTRE1可能对于RbohF遗传上位。此外,分析表明,外源施加H2O2抑制拟南芥26S蛋白酶体的活性,且PTRE1介导此抑制过程,有意思的是,ptre1中NADPH/NAD比率上升。这些结果表明细胞内的氧化还原过程可能通过RbohF和PTRE1的相互作用调控蛋白酶体活性,进而调控相关发育过程。  综上所述,我们筛选到ptre1的9个诱变回复株系sopt1-9,并定位了sopt1的突变基因-蛋白酶体α5亚基PAE1,遗传和生化的数据表明PTRE1通过PAE1及同源蛋白PAE2调控26S蛋白酶体的活性,从而参与调控拟南芥的生长发育过程;同时我们还鉴定到PTRE1的相互作用蛋白RbohF,表明氧化还原过程可能参与了蛋白酶体活性的调控。PTRE1回复子以及相互作用蛋白的获得为进一步解析PTRE1功能以及其调控26S蛋白酶体活性的分子作用机制提供了重要线索。
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