目的:间充质干细胞作为干细胞的一种,具有自我复制和多向分化能力,其常规体外培养方法使用血清作为添加物,维持细胞生长,但其不可控因素过多,为细胞体外培养带来风险,无血清培养成为必然趋势。本研究希望在规避血清的基础上,对市面上较为常用的不同类型的血清替代物进行比较,评价他们的优势劣势及在大规模细胞体外培养中应用的可能性,通过多方面鉴定,选出一种目前较为适宜的血清替代物,通过一系列鉴定判断其完全替代血清的可能性,探讨此种替代物能否以较低添加浓度的情况下满足细胞的连续传代扩增,以降低培养成本。为细胞体外培养工艺的改进提供数据参考。方法:1、选取符合标准的新生儿脐带,分离后培养,传代,部分细胞冻存备用,另一部分按照传统血清培养技术对细胞培养后参考国际间充质干细胞鉴定标准对其进行检测鉴定。2、以常规的动物血清培养体系作为对照,选择两种目前较为普遍应用的商品化干细胞培养血清替代物,即化学成分限定血清替代物(K物)、血小板裂解物(G物),将从脐带组织中分离出的间充质干细胞通过连续传代培养并记录细胞生长曲线的方式对血清替代物的作用进行评价,并通过对连续传代培养后的细胞进行形态观察、流式细胞检测表面标志物以及诱导三系分化等方法对细胞的干性进行评价。3、通过上述实验选出理想血清替代物(G物),除传代外,在脐带组织分离后作为原代培养基添加成分和冻存保护液成分对血清进行全程替代,将有血清培养基作为对照,观察原代细胞生长状态,冻存复苏后的细胞连续传代,计数并绘制生长曲线描述细胞生长状态,对P6代细胞进行流式检测和三系分化诱导鉴定细胞干性。4、最终找到一种更佳的干细胞体外培养血清替代物(G物),按照替代物浓度的不同设置4组实验组,以常规血清培养为对照,将P2代细胞复苏后进行连续传代培养,评价血清替代物的浓度对体外细胞培养的影响。5、将细胞按照接种浓度的不同,设置4组实验组,使用上述实验筛选出的最佳添加物浓度培养体系进行培养,以常规血清培养为对照,细胞连续传代后,根据计数结果绘制生长曲线,对P6代细胞进行流式检测和三系诱导分化,评价间充质干细胞的干性。6、复苏以G物为冻存保护剂冻存的细胞,以含10%FBS的培养基作为对照组,含5%G物的培养基作为实验组,对复苏细胞进行连续传代培养,传至P15代,通过每代计数绘制生长曲线反应细胞增殖情况,对P15代细胞进行表型检测和三系分化诱导,以确定细胞是否符合国际间充质干细胞鉴定标准。结果:1、传统血清体外培养的方式得到的间充质干细胞,符合国际间充质干细胞的鉴定标准。2、将K物和G物培养的间充质干细胞同血清培养的间充质干细胞进行对比,P3代开始,K物培养的间充质干细胞出现体积变大、融合度不足60%等细胞状态变差的现象,到P6代时,细胞融合度已不足30%,且细胞老化严重,数量过少,已无法进行后续实验操作。而G物在整个传代培养过程中,每代细胞的融合度均能达到80%以上,且细胞形态良好,数量同对照组无明显差异。3、原代细胞培养第2-3天后镜下观察,可见少量贴壁细胞从组织块周围爬出,细胞呈短粗的梭形或山形等多种细胞形态,且细胞间隙较大,生长缓慢,实验组与对照组无明显差异。培养10-14天后细胞融合度达50%以上,形态均匀一致,两组无明显差异。P1代传代5天后,两组细胞融合度达到80%以上,回收细胞计数,两组仍无明显差异。冻存复苏后对细胞传代培养至P6代,实验组细胞融合度略好于对照组,且收获的细胞数量较对照组略高,流式结果和三系分化诱导结果同对照组无明显差异。4、以含10%FBS的培养基为对照,通过不同G物浓度传代对比发现,含5%、4%、3%G物的培养基培养的细胞扩增效率更高,含2%G物的培养基培养的细胞与对照组接近,而含1%G物的培养基培养的细胞扩增效率明显低于对照组。5、此G物能够满足细胞低密度接种培养,本实验以含10%FBS的培养基,接种密度1×10~4个细胞/cm~2作为对照组,实验组使用含5%G物的培养基,接种密度分别为2×10~3个细胞/cm~2、4×10~3个细胞/cm~2、6×10~3个细胞/cm~2、8×10~3个细胞/cm~2、1×10~4个细胞/cm~2连续传代,结果显示,接种密度为2×10~3个细胞/cm~2的条件下细胞增殖扩增较快,但随着低密度连续传代,细胞出现老化、体积增大、扩增速度减慢的问题,接种密度为4×10~3-6×10~3个细胞/cm~2的条件下细胞扩增效率较高,且未出现细胞老化和体积增大的问题。6、以含10%FBS的培养基为对照组,实验组使用含5%G物的培养基,复苏细胞,以两种培养基进行培养并连续传代至P15,结果显示实验组的细胞扩增效率明显优于对照组,细胞形态稳定,且P15代细胞的表型及分化潜能均保持稳定。结论:化学成分限定的血清替代物尚无法满足细胞长期扩增的需要,血小板裂解物基本能够替代血清的功能,且较低添加浓度即可满足细胞长期的传代扩增所需,同时,较低接种密度条件下也可保证细胞的快速扩增,提高了细胞传代比例。在较长时间的连续传代下也能保持稳定。