疟疾是一种由媒介按蚊传播的传染性寄生虫病,全球广泛流行。我国的疟疾流行以间日疟为主,虽然我国已成功启动了消除疟疾行动计划,但本世纪前十年中部地区曾经出现间日疟疫情回升,表明疟疾防治工作仍需加强。间日疟原虫感染者血液中的原虫密度通常较低,由于漏诊病例有可能成为当地传播的潜在传染源,因此,及时有效地发现病例,无论是在疟疾控制阶段,还是疟疾消除进程中,都具有十分重要的意义。显微镜血涂片检查是经典的疟疾实验诊断方法,不但需要器材,操作费时费力,检测结果很大程度上依赖于镜检人员的经验和责任心,在疟疾低流行区漏检率高,已不能满足当前疟疾消除的高要求。近年来,基于免疫层析的疟疾快速诊断技术(Rapid Diagnostic Tests, RDTs)发展较快,因其特异性和敏感性均较高,无需仪器设备,操作简单,结果易判读,实施较为方便,非常适合疟疾现场应用,其有效性在以恶性疟流行为主的国家和地区已经得到证实,WHO也给予了高度重视,更改了RDT用于疟疾诊断的指针,强调只要条件允许,所有疑似病例均应在治疗之前,进行实验室疟疾病原检测。然而,迄今为止,仍无适合间日疟诊断的RDT可用,主要原因在于缺少敏感度高,特异性强的间日疟原虫靶抗原,由于我国以间日疟流行为主,因此,迫切需要研究开发适合现场应用的间日疟快速诊断技术。间日疟原虫(Plasmodium vivax, P. vivax)的体外培养技术尚不成熟,难以提供大量实验材料,从感染者采集的血样,其疟原虫密度低,且含有难以去除的宿主白细胞,因此,高纯度的间日疟原虫样本材料来源困难,已成为探寻间日疟原虫特异性抗原的重要瓶颈之一。通过基因重组表达制备的蛋白纯度高,抗原性和天然蛋白类似,可成为解决缺少间日疟原虫特异性诊断抗原的新途径之一。醛缩酶(Aldolase, ALD)是疟原虫糖酵解过程中的一种关键酶,以其作为检测靶点的RDT,在恶性疟检测中也显示出了较好的效果。间日疟原虫醛缩酶(PvALD)的基因序列已知,体外表达PvALD用于制备单抗,是解决缺乏间日疟特异性快速诊断工具的一条可行的途径。泛种特异性抗疟原虫单抗M26-32,能识别包括间日疟原虫在内的五种疟原虫,对其抗体属性的改造,可使之适于标记和检测,利用已有间日疟原虫cDNA文库和M26-32单抗的研究基础,可筛选其潜在的间日疟原虫靶抗原基因。间日疟原虫基因组的正式发布,也为筛选新的间日疟原虫特异性抗原提供了新思路,蛋白序列中出现高度重复,是恶性疟原虫的重要特征,最早被广泛应用的RDT靶抗原恶性疟原虫富组氨酸蛋白2(PfHRP-2)存在着明显串联重复序列。根据基因组信息,对间日疟原虫全部蛋白序列数据进行挖掘和筛选,是开发潜在新型间日疟原虫特异性抗原的新手段之一。本研究根据我国间日疟流行特点,结合疟疾防治新时期对新型快速诊断技术的实际需求,围绕缺少高敏感性间日疟原虫特异性抗原这一科学问题展开研究。通过采用新的生物信息学手段,挖掘间日疟原虫基因组数据中全部蛋白序列中的重复序列信息,联合使用多参数线性B细胞表位预测方法,筛选间日疟原虫特异性抗原肽。借鉴恶性疟原虫诊断性抗原研究的成功经验,选择与乳酸脱氢酶(pLDH)属性相似的间日疟原虫醛缩酶作为靶标,克隆其基因并表达重组蛋白,用于制备具有间日疟诊断价值的PvALD单抗。在已有泛种特异性单抗M26-32和间日疟原虫cDNA文库的研究基础上,改造其抗体的属性,使之适于标记和检测,并筛选其潜在的间日疟原虫靶抗原基因。结合新材料技术,研制用于处理疟原虫感染血样的新型疟原虫滤器,使之适合纯化间日疟原虫感染红细胞,为快速简便地获取虫体进行抗原研究提供技术支持。第一部分基于蛋白重复序列及线性B细胞表位预测筛选间日疟原虫特异性抗原肽【目的】建立一种从间日疟原虫基因组数据库中挖掘蛋白重复序列的方法,运用线性B细胞表位预测工具分析潜在的间日疟原虫特异性抗原肽,并使用实验动物验证。【方法】从PlasmoDB网站下载V6.0版FASTA格式间日疟原虫蛋白序列文件,去除冗余数据,格式化导入SQL数据库。用Delphi语言编写重复序列查找软件,以一定长度的短肽序列为单位,逐一检索其在全部蛋白序列中的重复次数,并输入到SQL数据表中。经过运算,统计出重复序列较高的1,000个短肽,提交到BcePred网站,联合使用4项参数进行连续B表位预测,再经相似性比较,优选其中具有间日疟原虫特异性的肽进行合成,偶联KLH,免疫BALB/c小鼠。分别使用肽-ELISA法检测免疫鼠血清和自然感染间日疟患者血清中抗合成肽抗体滴度。【结果】PlasmoDB V6.0版间日疟原虫全部蛋白序列为5,432个,经导入SQL数据库,由自编软件分析其中16肽的重复次数,共获得了约300万行数据,经统计筛选出重复序列较高的1,000个序列,逐一由BcePred网站四项参数联合预测线性B细胞表位,以4项参数中3项达到或超过阈值为筛选条件,获得22个候选肽,经聚类分析和相似性比较,优选了6个具有潜在间日疟原虫特异性表位的肽,人工合成并偶联KLH后,免疫BALB/c小鼠。经四次全程免疫后,肽-ELISA分别检测小鼠血清,6个合成肽的滴度均超过1:9,000。20例间日疟血清检测结果的阳性率从5%~40%不等。【结论】建立了从间日疟原虫基因组数据库中挖掘蛋白重复序列的新方法,所获肽序列经线性B细胞表位预测,得到6个间日疟特异性肽,经动物实验证实均能诱导产生高滴度抗体。第二部分间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达及单克隆抗体制备【目的】克隆间日疟原虫醛缩酶编码序列,分别用原核和真核两种体系表达重组间日疟原虫醛缩酶,并制备单克隆抗体。【方法】根据间日疟原虫模式株Salvador I的醛缩酶编码区设计带酶切位点的引物,以现场采集间日疟患者血样中DNA为模板,PCR扩增,分别将产物插入到pET32c和pPIC9K载体上,转化大肠杆菌DH5α,获得相应的重组质粒。原核重组质粒转入表达菌BL21(DE3),诱导表达并经His标签纯化重组蛋白。真核重组质粒线性化后,转入毕赤酵母GS115,诱导表达后纯化重组蛋白。将原核、真核表达的两种重组PvALD作为抗原,交替使用,并采用腹腔和皮下多点不同注射途径,免疫BALB/c小鼠后,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗重组PvALD抗体杂交瘤细胞株,制备抗重组PvALD单抗。【结果】间日疟醛缩酶的PCR产物为1.1 kb,经酶切、连接、转化、筛选,获得相应重组质粒,经双酶切和测序鉴定,成功构建了pET32c-PvALD原核表达质粒和pPIC9K-PvALD真核表达质粒。pET32c-PvALD转化到BL21(DE3),经IPTG诱导表达,所获包涵体经变性、His标签纯化和复性,其重组蛋白的分子量约60 kD。pPIC9K-PvALD重组质粒线性化后,转入GS115毕赤酵母,经甲醇诱导可溶性表达,其重组蛋白的分子量为40 kD。两种重组蛋白交叉免疫小鼠,取脾细胞与SP2/0融合,经HAT筛选和ELISA三轮筛选,获得11株分泌抗重组PvALD单抗的杂交瘤细胞株,培养上清ELISA结果显示滴度从1:320到1:1,280之间。【结论】克隆了间日疟原虫醛缩酶基因,利用原核表达系统表达并纯化了重组PvALD融合蛋白,利用真核表达系统表达并纯化了重组PvALD蛋白。制备出11株分泌抗重组PvALD单抗的杂交瘤细胞株。第三部分泛种特异性抗疟原虫单克隆抗体M26-32免疫学特性研究【目的】改造天然IgM类M26-32单抗为单体IgM亚单位,胶体金标记天然和改造后两种M26-32用于检测疟原虫抗原。利用M26-32恶性疟原虫靶抗原基因筛选间日疟原虫cDNA文库。【方法】复苏培养M26-32杂交瘤细胞,接种BALB/c小鼠,收集含有单抗的腹水,用商品HiTrap IgM HP柱纯化腹水中的IgM抗体,并用L-半胱氨酸裂解IgM类M26-32单抗成单体IgM亚单位。经间接免疫荧光检定两种抗体的效价,并用胶体金标记,分别检测恶性疟原虫和间日疟原虫可溶性抗原。利用已知M26-32恶性疟原虫靶基因信息,设计引物,扩增红内期间日疟原虫SMART cDNA次级文库,对产物测序鉴定。【结果】接种20只小鼠,共采集约80 ml单抗腹水,经HiTrap IgM HP柱纯化,获得了纯度较高的M26-32单抗。经L-半胱氨酸裂解后,Native电泳显示天然IgM被裂解为单体亚单位,IFA结果显示,亚单位M26-32与天然五聚体IgM滴度无差别。经胶体金标记后,两种金标抗体均分别能检测1:100稀释的恶性疟原虫和1:10稀释的间日疟原虫可溶性抗原。根据M26-32单抗针对的恶性疟原虫靶抗原基因所设计的9对引物,扩增红内期间日疟SMART cDNA次级文库,产物电泳后切胶纯化,经测序得到的5个序列中,4个属于载体序列,1个为间日疟片段,但经3个读码框架翻译,均与M26-32已知表位序列不相符。【结论】建立了L-半胱氨酸裂解IgM类M26-32单抗为单体IgM亚单位及其胶体金标记的方法,为利用M26-32进一步制备相应快速诊断工具打下了基础。初步筛选了间日疟原虫cDNA次级文库,仍需探索更好的方法以用于筛选M26-32间日疟原虫靶抗原基因。第四部分纯化疟原虫感染血样用白细胞滤器的研制及其应用【目的】开发一种适用于处理疟原虫感染血样的白细胞滤器,评估其性能和在疟原虫相关研究中的应用价值【方法】设计相应模具并用注塑工艺制备滤器塑料外壳,接枝改性PBT(Polybutylene Terephthalate,聚对苯二甲酸丁二醇酯)熔喷无纺布裁剪后作为滤芯,组合后制备新型疟原虫滤器,并对其去除血样中白细胞的能力进行测试。当新型疟原虫滤器达到白细胞去除率>99%的要求后,在间日疟流行区现场评估其性能,并与经典CF11纤维素柱法进行比较,分别测定两种方法处理间日疟原虫感染血样的白细胞去除率,红细胞回收率,感染红细胞密度的变化,并进行体外短期培养,观察疟原虫发育情况。采用疟原虫滤器法分别处理恶性疟原虫感染者血样和伯氏疟原虫感染鼠血样,观察过滤处理前后白细胞和疟原虫的变化。【结果】具有3层无纺布滤芯的新型疟原虫滤器的白细胞去除率为99.31%,达到了设计要求,被用于现场评估。15例现场采集间日疟原虫感染血样,分别经新型疟原虫滤器和CF11柱法处理(样品血量各相当于全血5 ml),滤器法白细胞去除率为99.03%,优于CF11法(98.41%,P<0.01),滤器法红细胞回收率为95.48%,明显优于CF11法(87.05%,P<0.01),而两法处理后疟原虫密度无明显变化(t=0.067,P>0.05)。14例体外短期培养结果显示,滤器法去除白细胞后,疟原虫可以正常发育,与CF11注法相比,两者原虫密度、原虫发育期别比例及形态,无明显差别。镜检观察,与过滤前相比,恶性疟和伯氏疟原虫薄血膜涂片感染红细胞密度没有明显下降,原虫的发育期别比例和形态没有明显变化,厚血膜涂片中残留的白细胞大幅减少(<1个/10个油镜视野)。【结论】成功研制了一种适用于处理疟原虫感染血样的新型疟原虫滤器,适合处理间日疟、恶性疟原虫感染者血样,也适合处理伯氏疟原虫感染鼠血样。经现场应用评估,新型疟原虫滤器法白细胞去除率和红细胞回收率均优于CF11柱法。滤器法处理后的间日疟样本,可以为抗原研究提供更纯的研究材料,也适用于体外法短期培养。本法比CF11柱法更加简便快捷,同时适合实验室和现场应用。综上所述,本课题研究采用新的生物信息学方法,从间日疟原虫全基因组蛋白序列中查找重复序列入手,结合连续B细胞表位预测高通量筛选抗原肽,并对筛到的6个间日疟原虫特异性抗原肽进行了验证;采用分子生物学手段,克隆出了间日疟原虫醛缩酶基因,利用原核和真核表达体系分别表达出重组PvALD蛋白,并制备了11株分泌抗重组PvALD单抗的杂交瘤细胞株;应用免疫与分子生物学方法,改造了泛种特异性抗疟原虫单抗M26-32为单体IgM亚单位,使之易于标记和检测,并利用间日疟原虫cDNA文库,对其中潜在的间日疟原虫M26-32靶抗原基因进了初步筛选;利用新材料技术,研发出了适用于疟原虫感染血样处理的新型疟原虫滤器,为获取纯化的疟原虫抗原研究材料提供了更为高效便捷的工具。