小麦白粉病是一种在麦类植物中广泛发生的真菌性病害,严重威胁小麦安全生产,选育和利用抗病品种是最经济有效的病害控制策略。挖掘麦类植物中的抗白粉病基因、解析白粉病抗性的分子机制是选育抗病品种的重要基础。簇毛麦（Haynaldiavillosa L.）是小麦的二倍体近缘物种,广谱高抗白粉病,来源于簇毛麦的抗白粉病基因Pm21在我国抗病育种中被广泛利用。本实验室前期研究发现,除了典型的NBS-LRR类抗病基因NLR-V,丝氨酸苏氨酸激酶基因STPK1-V和编码U-Box类E3泛素连接酶基因CMPG1-V在簇毛麦广谱高抗白粉病中也发挥重要作用。已有研究表明,RING型的E3泛素连接酶基因MIEL（MYB30Interacting E3 Ligase）也参与调控植物抗病性。本研究在实验室已有的研究基础上,利用已经发布的麦类植物和其他禾谷类植物基因组信息,聚焦MIEL基因家族,鉴定分析其在不同物种中的成员数目、染色体分布、基因结构、表达特征;克隆簇毛麦MIEL家族不同成员,并研究其在抗白粉病中的功能和作用机理。取得的主要研究结果如下:1、禾本科植物MIEL基因家族的鉴定和系统进化分析在麦类植物（普通小麦、二粒小麦、节节麦、乌拉尔图小麦、大麦）、模式植物二穗短柄草、稻类植物（粳稻、籼稻、普通野生稻、南方野生稻、尼古拉野生稻、非洲栽培稻）以及黍亚科植物（高粱、玉米、谷子）共15个物种中,鉴定出1 13个MIEL家族基因,发现禾本科植物中MIEL基因家族成员数目较为保守。在二倍体、四倍体及六倍体普通小麦及其祖先种中,分别含有6个、12个、18个MIEL基因家族成员,且不同物种之间具有很好的共线性关系;在二倍体稻属植物中,栽培稻、野生稻及近缘物种中MIEL基因成员数目变化不大,为6-7个;在亲缘关系较远的黍亚科物种中,MIEL基因家族数目也在6-8个。根据系统进化树,MIEL家族基因可分为6个分支（Clade Ⅰ-CladeⅥ）,每一 Clade分支中,均存在麦类、稻类及黍亚科植物,且其聚为各自亚支,因而推测MIEL基因家族在黍亚科植物与稻类植物、麦类植物分化前均已存在。以上结果说明MIEL类基因是一类较为古老且在麦类植物中进化较为保守的基因家族。2、麦类植物中MIEL基因家族染色体定位、基因结构及其表达分析在麦类植物中,MIEL基因家族主要分布在第一、三、四、五部分同源群染色体上,第一、第三同源群中各含有6个MIEL基因,第四和第五同源群中各含有3个MIEL基因,且MIEL基因在普通小麦A、B、D亚基因组中染色体上的位置大部分能与其祖先种中所在位置一一对应。由于进化过程中4A-7A染色体结构重排,乌拉尔图小麦7A染色体上多出一个MIEL基因（TuG1812G0700005439.01）,但其4A染色体上少了相应基因,且基因TuG1812G0700005439.01能与普通小麦第四同源群染色体上的基因聚为一支。对普通小麦中MIEL基因家族的基因结构分析发现,MIEL基因家族成员内含子较多,均在11-14个之间;每一 Clade分支中直系同源基因的基因结构基本一致,内含子和外显子差别不大,而不同Clade分支中旁系同源基因则存在明显差异。利用公布的基因表达数据库,分析MIEL基因家族在普通小麦中的表达特征,结果发现,MIEL家族基因在不同品种的表达量基本相同,但同一品种中具有组织特异性表达。在受生物胁迫（白粉菌和条锈菌诱导）时,MIEL家族基因表达有所变化;在白粉菌处理不同时间段内,CladeⅠ、Clade Ⅱ、CladeⅣ、Clade Ⅴ及Clade Ⅵ分支中MIEL基因受白粉菌生理小种E09处理后均出现上调表达趋势,而Clade Ⅲ分支中MIEL基因受E09处理后则表现下调表达趋势;在条锈菌处理的不同时间段内,Clade Ⅰ分支中MIEL基因受条锈菌生理小种CYR31处理48h后出现下调表达趋势,而CladeⅣ、CladeⅤ及CladeⅥ分支中MIEL基因受CYR31处理24h后表达下降,但在48h及72h时表达量有所恢复。3、簇毛麦中MIEL-V基因家族的克隆及MIEL1-V的功能分析参考本实验室获得的簇毛麦转录组数据,利用同源克隆策略,在簇毛内克隆了3个MIEL-V基因,其中MIEL1-V发生了可变剪接,将其命名为MEL1.1-V与MIEL1.2-V,其余命名为 MIEL2-V和MIEL3-V。其中,MIEL1.1-V与MIEL1.2-V属于CladeⅢ分支,MIEL2-V和MIEL3-V分别属于CladeⅠ和CladeⅡ分支。荧光定量PCR分析发现,簇毛麦受白粉菌诱导后MIEL2-V与MIEL3-V表达有一定程度地下调,但后期表达量均慢慢恢复:白粉菌诱导前,MIEL1.1-V表达量明显高于MIEL1.2-V,受白粉菌诱导后,MIEL1.2-V表达变化不明显,而MIEL1.1-V总体下调表达,且表达下降明显。在普通小麦中瞬间表达MIEL1.2-V基因,可以显著提高白粉菌侵染后的吸器指数（63.1%,高于单独转化GUS对照的吸器指数49.0%,p<0.05）:利用大麦条花叶病毒诱导的基因沉默在普通小麦中沉默MIEL1基因,可以显著降低白粉菌侵染后的吸器指数。因此推测,MIEL1-V负向调控白粉病抗性。转基因RNAi试验发现,在感白粉病普通小麦品种扬麦158中沉默MIEL1,可以提高其白粉病抗性;利用CRISPR-Cas9在感白粉病普通小麦品种Fielder中靶向突变MIEL1基因,也增强了小麦对白粉病的抗性,进一步证明MIEL1在白粉病抗性中发挥负向调控作用。4、MIEL1-V调控白粉病抗性分子机制的初步解析实验室前期研究发现,簇毛麦基因CMPG1-V、HIPP1-V均能正向调控小麦白粉病抗性,且CMPG1-V能将HIPP1-V单泛素化。为了进一步研究MIEL1-V基因是否参与CMPG1-V及HIPP1-V调控的白粉病抗性通路,利用酵母双杂交实验,发现 MIEL1.1-V、MIEL1.2-V 与 CMPG1-V、MYB25-V 均互作,而 HIPP1-V仅与MIEL1.2-V互作。进一步利用扬麦158过量表达CMPG1-V（CMPG1-VOE）抗白粉病转基因系研究MIEL1-HIPP1-CMPG1三者之间的调控关系。对CMPG1-VOE受白粉菌诱导前后的转录组数据分析发现,受两个白粉菌生理小种（E26和E31）分别诱导24h时,扬麦158的MIEL1基因表达上调,而CMPG1-VOE的MIEL1基因表现先略微上调然后下调;受白粉菌生理小种E26诱导24h时,扬麦158和CMPG1-VOE中的HIPP1基因均出现上调趋势,但CMPG1-VOE上调更明显;受E31诱导时,扬麦158和CMPG1-VOE中HIPP1基因表达均无变化。由此可见,相较于受体扬麦158,CMPG1-VOE中MIEL1基因表达受白粉菌诱导后降低,而HIPP1基因表达受白粉菌诱导后上升。推测三个基因在小麦抗白粉病中发挥作用,可能存在调控关系。分析受不同激素诱导后簇毛麦表达特征发现,MIEL1-V受SA、ET及H2O2诱导后显著上调表达。进一步分析RNAi-MIEL1的转基因材料中SA通路相关基因（NPR1和PR1）、ET通路相关基因（PR3）及H2O2合成基因（NADPHOX）表达趋势,结果发现,沉默MIEL1基因后,NADPHOX显著上调表达,PR1及PR3显著下调表达,而NPR1表达几乎无变化。推测MIEL1基因对于白粉病抗性通路的调控与H2O2合成及ET通路相关基因的表达有关。对MIEL1基因突变体的表型进行分析发现,在抗白粉病Cadenza品种中突变MIEL1基因后,植株叶片出现了自发性细胞程序性死亡,进一步说明了MIEL1基因可能通过调控植株的PCD过程来控制植株对白粉病的抗性。