【摘 要】
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连翘（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）为木犀科（Oleaceae）连翘属（Forsythia）落叶灌木,早春开花,开花数量多且花色金黄艳丽,具有较强的适应性和抗病虫害能力。连翘不仅是我国大宗、常用中药材,而且有着良好的生态价值、观赏价值,是北方地区优良的早春观花灌木。基因工程育种是一种有效的育种手段,由于缺少转基因体系阻碍了连翘的基因工程育种,导致目前缺少栽培品种。现
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连翘（Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl）为木犀科（Oleaceae）连翘属（Forsythia）落叶灌木,早春开花,开花数量多且花色金黄艳丽,具有较强的适应性和抗病虫害能力。连翘不仅是我国大宗、常用中药材,而且有着良好的生态价值、观赏价值,是北方地区优良的早春观花灌木。基因工程育种是一种有效的育种手段,由于缺少转基因体系阻碍了连翘的基因工程育种,导致目前缺少栽培品种。现代分子生物技术,尤其是植物组织培养和基因工程的发展,为连翘基因工程育种和新品种的改良提供了技术支持。本试验选取连翘茎段为外植体进行组培再生体系的探讨,以无菌苗叶片、下胚轴和子叶为外植体进行遗传转化受体系统的探索,确定了连翘外植体对卡那霉素和潮霉素的耐受力,使用根癌农杆菌介导法将携带β-葡萄糖苷酸酶（GUS）和潮霉素磷酸转移酶（Hpt）选择标记基因的p CAMBIA1301载体转化到连翘外植体中,对其转化条件进行优化,试验结果如下:1、以连翘茎段为外植体,75%酒精消毒30 s,0.1%（m/v）升汞消毒8 min,连翘茎段污染率较低为23.33%、褐化情况较轻及成活率最高为66.67%;茎段最适启动培养基为:MS（Murashige and Skoog）+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3mg·L-1+Sucrose 30 g·L-1+Agar 7g·L-1,腋芽萌发时间为3～5 d,腋芽诱导率为97.00%;最适生根培养基为:1/2 MS+IBA 0.2mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+Sucrose 25 g·L-1+Agar 7 g·L-1时,生根率可达到73.54%,生根速度快,根长且粗壮。2、连翘种子最佳消毒处理:75%酒精消毒30 s,再用0.1%的升汞消毒12 min,污染率较低为16.88%,发芽率较高,无菌苗长势良好。WPM（Woody Plant Medium）培养基子叶和下胚轴愈伤组织诱导率高于MS,因此以WPM培养基作为愈伤组织诱导培养基,连翘下胚轴和子叶最适诱导培养基为:WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+Sucrose 30 g·L-1+Agar 7 g·L-1,诱导率分别为89.67%和89.00%,子叶愈伤组织最佳分化培养基为WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+Sucrose 30 g·L-1+Agar 7 g·L-1,诱导率为35.56%,下胚轴愈伤组织不定芽诱导培养基为WPM+6-BA 2.0 mg·L-1+KT 0.3 mg·L-1+Sucrose 30 g·L-1+Agar 7 g·L-1。3、连翘外植体对卡那霉素不敏感,而对潮霉素敏感,依据外植体愈伤组织诱导状况得知,下胚轴潮霉素致死浓度为20 mg·L-1,子叶潮霉素致死浓度为15 mg·L-1;抑菌剂羧苄青霉素浓度为400 mg·L-1,可以有效抑制农杆菌的生长,同时对外植体抑制作用较小。4、下胚轴在菌液浓度OD600=0.8,真空辅助侵染3 min后,再常规侵染浸泡至20 min,共培养4 d,是最优转化条件,GUS表达率最高为52.72%;子叶在菌液浓度OD600=0.8,真空辅助侵染1 min,再常规浸泡至20 min,共培养3 d,是最优转化条件,GUS表达率较高为33.31%;较长时间的共培养使农杆菌大量繁殖,外植体死亡。本实验以连翘无菌苗为材料,建立了连翘再生体系和遗传转化受体系统,探讨了菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对遗传转化的影响,筛选了转化的最优条件,为利用基因工程技术对连翘基因工程育种和优良性状改良奠定了基础。
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