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乳房炎是奶牛最重大的疾病,每年给乳制品行业造成数十亿美元的经济损失。转基因奶牛分泌的抗菌肽表现出抗乳房炎的特性。体细胞基因打靶与核移植技术相结合为生产转基因动物提供了强大的方法。最近的研究发现,锌指核酸酶诱导的精确的双链断裂可以促进外源的DNA片段整合到已知的基因组位点,导致高效的位点特异性的基因整合。锌指豁口酶是一种可编辑的核酸酶,它可以通过对锌指核酸酶的改造来诱导在基因组DNA上产生位点特异性单链断裂或形成缺口,从而导致同源性定向修复。锌指核酸酶介导的基因破坏已经在猪和牛上获得证明,但是它们没有被用于大型家畜动物的基因定点插入。本研究的目的是通过有效的可重复的基因打靶在牛胎儿成纤维细胞（BFFs）中利用锌指核酸酶（ZFNs）和锌指豁口酶（ZFNickases）技术将外源的人溶菌酶基因和溶葡萄球菌素基因定点插入牛β一酪蛋白位点（CSN2）,这样就可以使基因打靶克隆牛乳腺产生外源的抗菌蛋白。本研究的主要内容如下：1.在BFFs中评估ZFNs活性不同浓度的ZFNs表达质粒与pEGFP-Cl质粒共转染BFFs。转染的细胞群中ZFNs介导的靶位点突变频率通过CEL-I分析测定。为了简单快速的测定ZFNs介导的CSN2位点的突变情况,提取转染ZFNs3天后的BFFs基因组用于扩增ZFNs打靶区域。PCR产物直接送测序。2.高效的ZFNs诱导人溶菌酶（hLYZ）插入BFFs中CSN2位点为了探讨高效的ZFN诱导外源基因定点整合到内源基因组位点,我们将打靶载体pCSN2-hLYZ-Neo-GFP与ZFNs表达质粒共转染BFFs。稳定转染的细胞克隆通过G418（600μg/mL）筛选7-9d后获得。获得的细胞克隆转移到48孔板扩大培养用于PCR检测。我们发现15.8%（84）的G418阳性细胞克隆包含有正确的打靶细胞。3. hLYZ基因和EGFP报告基因在体外牛乳腺上皮细胞（BMECs）中表达含有hLYZ基因的载体pEGFP-C-hLYZ, pEGFP-S-hLYZ and pEGFP-I-hLYZ被相继构建成功并成功转染三代的BMECs。转染pEGFP-C-hLYZ和pEGFP-S-hLYZ的BMECs转染48h后观察到绿色荧光蛋白的表达。共转染pEGFP-I-hLYZ和ZFNs表达质粒的BMECs,激素诱导48h后也观察到绿色荧光蛋白的表达。4.突变ZFNs的催化结构域获得ZFNickases为了使ZFNs具有产生链特异性的缺口活性,我们对ZFNs的一个分子中的FokI催化结构域进行点突变。这些数据表明引入D450A突变的FokI不具有切割活性,从而产生了一种有效的,单链切割的ZFNickases。5. ZFNickases促进同源重组介导的位点特异性基因插入我们通过将携带有剪切拼接位点的Lys成熟肽序列插入到通用打靶载体pTCSN2构建了基因打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP。我们将这一打靶载体与ZFNs/ZFNickases表达载体共转染BFFs。我们发现8.7%（99）G418阳性细胞克隆含有正确的基因打靶细胞。6.通过体细胞核移植（SCNT）生产转基因克隆牛基因打靶克隆胚是通过从屠宰母牛卵巢采集的卵母细胞产生的。三个转hLYZ基因的细胞系来自六个适于核移植的细胞克隆被用来作为核供体细胞。发育良好的克隆胚移植到118头受体牛子宫,最终获得5头存活的转基因小牛。12个转Lys基因的细胞系（其中六个来自ZFNickases诱导组,六个来自ZFNs诱导组）被用来进行体细胞核移植。140头怀孕受体牛中19头妊娠至足月（16头来自ZFNickases诱导组,3头来自ZFNs诱导组）,最终获得14头基因打靶小牛,出生体重45-55kg。其中的6头出生后不久死亡,而剩余的8头存活超过一个月。7.分析转基因克隆牛从克隆牛组织提取基因组进行Junction PCR和Southern blot分析。两段的Junction PCR结果显示所有克隆牛样品均发生了打靶。Southern blot分析显示5’同源臂外侧探针和内部的hLYZ或Lys探针与大小正确的限制性酶切片段杂交。这些数据表明携带外源基因定点插入的克隆牛可以通过核移植获得。为了保证牛奶原始成分不变的前提下生产牛奶中含有人溶菌酶或溶葡萄球菌素的转基因牛,我们没有刻意筛选纯合整合的阳性细胞克隆进行核移植。转基因奶牛的牛奶体外检测了对各种微生物的抗性。通过乳房内灌注Sta. aureus,E.coli or Str. Agalactiae来验证转基因牛乳房抗感染能力。所有上述结果表明ZFNs/ZFNickases处理的细胞可成功地用于体细胞核移植,并生产成活的基因打靶克隆奶牛。此外,基因打靶克隆奶牛的乳汁中可以分泌人溶菌酶和溶葡萄球菌素,体外实验证明转基因牛奶具有杀死金黄色葡萄球菌的能力。这一策略的成功将促进一种新的转基因技术在农业和生物医药领域的应用。