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目的研究一氧化碳释放分子2(CORM-2)对脓毒症大鼠心肌功能障碍的保护作用,并探索其作用机制。方法第一部分:(1)分组及处理:72只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组(Control组)28只、脓毒症组(LPS组)44只;各组分别随机抽取20只观察大鼠10天生存率;LPS组剩余24只依据造模后时相分为LPS 6h组、LPS 12h组、LPS 24h组3个亚组,每组8只。脓毒症组腹腔注射10mg/kg脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立大鼠脓毒症模型,对照组注射等量生理盐水。(2)观察指标:LPS各亚组分别于各时相点行超声心动图检查心脏结构与功能,并于测定心功能后留取心肌组织及血清。光镜观察心肌组织病理形态结构,透射电镜观察心肌超微结构。ELISA法检测大鼠静脉血清心肌肌钙蛋白(c Tn I)、脑钠肽(BNP)浓度。第二部分:(1)分组及处理:将140只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组(Control组)、脓毒症组(LPS组)、一氧化碳释放分子-2预处理组(CORM-2组)、灭活型一氧化碳释放分子-2预处理组(iCORM-2组)、二甲基亚砜对照组(DMSO组),每组28只。LPS 10 mg/kg腹腔注射建立大鼠脓毒症模型;Control组腹腔注射等剂量的生理盐水。CORM-2组、iCORM-2组分别给予8mg/kg CORM-2或iCORM-2于注射LPS前1h腹腔注射;DMSO组于注射LPS前1h,腹腔注射同剂量溶于生理盐水的DMSO。(2)观察指标:各组分别抽取20只大鼠观察10 d存活率;剩余大鼠于制模后12h行超声心动图检查,并于测定心脏结构与功能后留取心肌组织及血清。光镜观察大鼠心肌病理形态改变;电镜观察心肌线粒体超微结构,每组随机选取5只大鼠的电镜标本,每只大鼠的电镜标本以12000X的放大倍数随机选取5个视野,每个视野随机选取20个线粒体进行统计分析,根据Flameng评分标准对线粒体超微结构进行评分,使用Image-Pro Plus 6.0软件测量线粒体的长度和宽度,评估线粒体的形态改变。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)和脑钠肽(BNP)水平;检测心肌线粒体呼吸链复合体IV活性;Western blot检测线粒体Fis1、Mfn2及Opa1蛋白表达水平。结果第一部分:(1)生存情况:与Control组比较,LPS组大鼠10天生存率明显降低[10%vs 100%,P<0.05]。(2)心脏结构与功能比较:超声心动图可见,与Control组比较,LPS各个时相组LVEDD(左室舒张末期内径)、LVEDV(左室舒张末期容积)均无明显差异(均P>0.05)。各组LVESD(左室收缩末期内径)与Control组比较,LPS 6h组无差异,LPS 12h组和LPS 24h组升高[LVESD(mm):3.51±0.63、3.88±0.97 vs 2.66±0.23,均P<0.05],且高于LPS 6h组(均P<0.05)。各组LVESV(左室收缩末期容积)与Control组比较,LPS6h组无差异(均P>0.05),LPS 12h组和LPS 24h组均升高[LVESV(μl):118.20±51.91、165.90±89.14 vs 50.50±13.45,均P<0.05],且高于LPS 6h组(均P<0.05)。LPS 12h组和LPS 24h组LVESD和LVESV比较无差异(均P>0.05)。各组LVEF(左室射血分数)和LVFS(左室缩短分数)与Control组比较,LPS 6h组LVEF无显著性变化(P>0.05),仅LVFS(左室缩短分数)降低[LVFS(%):41.62±4.74 vs 46.10±2.63,均P<0.05];LPS 12h组和LPS 24h组LVEF和LVFS均降低[LVEF(%):63.59±1.65、50.80±7.91vs 82.91±2.46;LVFS(%):29.85±1.17、22.24±4.20 vs 46.10±2.63,均P<0.05],且LPS 12h组和24h组LVEF和LVFS均低于6h组[LVEF(%):63.59±1.65、50.80±7.91 vs 78.38±4.54;LVFS(%):29.85±1.17、22.24±4.20 vs 41.62±4.74,均P<0.05],LPS 24h组LVEF、LVFS较LPS 12h组比较,进一步降低(均P<0.05)。(3)心肌损伤标志物:与Control组比较,LPS 6h组、LPS 12h组、LPS 24h组血清c Tn I水平均升高[c Tn I(pg/ml):3438.88±1334.22、6396.79±2364.78、11670±3142.53 vs 320.53±111.57,均P<0.05],且LPS 24h组血清c Tn I水平升高更明显(P<0.05)。与Control组比较,LPS 6h组血清BNP水平有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05),而LPS 12h组、LPS 24h组血清BNP水平升高明显[BNP(pg/ml):6552.51±1900.33、9115.11±1472.71 vs 1262.75±800.66,均P<0.05];与LPS 12h组比较,LPS 24h组血清BNP水平有升高趋势但差异无统计学意义(P>0.05)。(4)心肌组织病理学与超微结构观察:与Control组比较,LPS 12h组和LPS 24h组心肌病理形态及超微结构损伤明显。第二部分:(1)生存情况:Control组大鼠全部存活;与Control组比较,LPS组、CORM-2组、iCORM-2组、DMSO组大鼠10天存活率均明显降低[10%、70%、25%、15%vs 100%,均P<0.05];但CORM-2组10天存活率高于LPS组处理其余各组(均P<0.05)。(2)心脏结构与功能比较:与Control组比较,超声心动图可见,LPS组、CORM-2组、iCORM-2组、DMSO组LVEDD、LVEDV在LPS处理后12h均无明显性变化(均P>0.05)。与Control组比较,LPS组、iCORM-2组、DMSO组LVESD、LVESV增高(均P<0.05);而CORM-2组LVESD、LVESV较Control组比较虽有升高趋势,但无显著性差异(均P>0.05),且CORM-2组LVESD、LVESV均低于LPS处理其他各组(均P<0.05)。而与Control组比较,LPS处理四组LVEF、LVFS均降低(均P<0.05),但CORM-2组LVEF、LVFS较LPS组、iCORM-2组、DMSO组升高[LVEF(%):75.54±2.59vs 63.58±1.66、63.30±5.09、64.15±5.57;LVFS(%):38.90±2.16 vs 29.85±1.17、29.80±3.24、30.45±3.62,均P<0.05]。(3)心肌损伤标志物:与Control组比较,LPS处理其余四组大鼠血清c Tn I、BNP水平均升高(均P<0.05);而CORM-2组c Tn I、BNP水平均较LPS组、iCORM-2组、DMSO组降低[c Tn I(pg/ml):3283.54±803.50 vs 6449.18±1105.10、5919.21±1068.27、6349.80±1153.08;BNP(pg/ml):3456.62±905.85 vs 6070.18±1287.62、5581.13±1161.17、5974.89±988.89,均P<0.05]。(4)心肌组织病理形态与超微结构观察:LPS组、iCORM-2组、DMSO组大鼠光镜下显示心肌组织病理形态损伤严重,透射电镜下显示线粒体肿胀,部分出现空泡状改变;然而CORM-2组心肌病理形态及线粒体超微结构完整性明显优于LPS处理其余各组。与Control组比较,LPS处理四组线粒体Flameng评分增高(均P<0.05);CORM-2组线粒体Flameng评分较LPS组、iCORM-2组、DMSO组降低[Flameng评分:1.27±0.82 vs 3.14±0.62、3.10±0.69、3.11±0.72,均P<0.05]。与Control组比较,LPS组、iCORM-2组、DMSO组线粒体长度和长宽比均降低(均P<0.05);CORM-2组线粒体长度和长宽比与Control组比较无差异(P>0.05),但较LPS组、iCORM-2组、DMSO组增加[线粒体长度(μm):1.19±0.31 vs 1.02±0.28、1.03±0.26、1.01±0.32;线粒体长宽比:1.67±0.46 vs 1.48±0.47、1.48±0.39、1.51±0.38,均P<0.05]。(5)线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性比较:与Control组比较,LPS处理其余四组线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性均降低(均P<0.05)。而CORM-2组线粒体呼吸链复合体Ⅳ活性较LPS组、DMSO组升高[U/g:100.65±12.98 vs 74.25±34.12、75.90±15.73,均P<0.05],CORM-2组粒体呼吸链复合体Ⅳ活性较iCORM-2组有升高趋势,但无统计学意义(P>0.05)。LPS组、iCORM-2组、DMSO组间比较,上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。(6)心肌线粒体Fis1、Mfn2及Opa1蛋白表达水平比较:与Control组比较,LPS处理四组Fis1表达明显增高;而CORM-2组Fis1表达水平较LPS组、iCORM-2组、DMSO组均降低[Fis1:0.586±0.031 vs 0.920±0.054、0.856±0.036、0.924±0.053,均P<0.05]。与Control组比较,LPS组、iCORM-2组、DMSO组Mfn2、Opa1表达降低;而CORM-2组Mfn2、Opa1表达水平高于LPS组、iCORM-2组、DMSO组[Mfn2:0.919±0.063 vs 0.459±0.069、0.550±0.104、0.400±0.077;Opa1:0.767±0.062 vs 0.526±0.047、0.518±0.092、0.496±0.077,均P<0.05],LPS组、iCORM-2组、DMSO组上述三种蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05)。结论1、CORM-2可改善脓毒症大鼠心肌功能障碍、减轻心肌损伤,提高大鼠生存率。2、CORM-2可抑制脓毒症大鼠心肌线粒体过度分裂、促进线粒体融合,改善线粒体呼吸功能,可能是其保护机制之一。