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帕金森病(parkinson’s disease,PD)是一种以中老年人为主体的的神经退行性疾病,其病理特征为多巴胺(dopamine,DA)神经元进行型变性、凋亡。迄今为止对该疾病的发病机制还不明确,临床上也没有可靠有效的治疗方法。据研宄表明:脑肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)可以通过血管紧张素l(angiotensintype 1 receptor,AT1)受体在神经炎症、氧化应激和多巴胺能变性的发展中发挥重要作用。不同的致病因素如衰老、神经毒素、促炎因子都可以导致RAS的激活,局部或旁分泌的RAS是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶的激活剂,并且参与氧化应激和炎症反应。大量的实验结果表明血管紧张素II(angiotensinll,AngII)诱导小胶质细胞活化介导的神经炎症与PD的病程有密切的关系。鸡豆黄素A(biochaninA,BiochA)是异黄酮类植物雌激素,我们先前研宄表明BiochA可以抑制LPS诱导的小胶质细胞活化,但对于它在Angll诱导小胶质细胞活化介导的神经炎症作用尚不明确。目的:探讨鸡豆黄素A对Angll诱导小胶质细胞活化的影响及其机制的研宄。方法:一、将体外培养BV2细胞分成6组:(1)Control组;(2)AngU(25nM)组;(3)Angll(50nM)组;(4)Angll(100nM)组;(5)Angll(200nM)组;(6)AngU(400nM)组,除control外,其余每组加入相应浓度的Angll并处理细胞24h,采用噻唑蓝比色分析法(MTT)检测Angll对细胞的毒性;并采用Griess试剂盒法,检测细胞上清液中一氧化氮(nitricoxide,NO)的含量。二、将BV2细胞分成7组:(1)Control组;(2)Angll(100nM)组;(3)血管紧张素II-1型受体拮抗剂氯沙坦Losartan(lpM)组;(4)Angll(100nM)+Losartan(ljxM)组;(5)AngH(100nM)+BiochA(1.25|iM)组;(6)Angll(lOOnM)+BiochA(2.5pM)组,(7)AngII(100nM)+BiochA(5.0joM)组,除Control组外,各组分别加入相对应的药物,共同孵育24h。采用DCFH-DA探针法对细胞内的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量进行检测。三、将BV2细胞分成5组:(1)Control组;(2)Angll(100nM);(3)AngII(100nM)+BiochA(l,25nM);(4)AngII(100nM)+BiochA(2.5^M);(5)AngII(100nM)+BiochA(5pM);除Control组外,各组分别加入相对应的药物,共同孵育24h。釆用蛋白免疫印迹法(western blot),检测AT1的蛋白表达情况。四、将BV2细胞分成5组:(l)Control组;(2)AngII(100nM)组;(3)Losartan(l[iM)组;(4)如名11(10〇111^1)+1^〇33113111(1|111^1)组;(5)如￡11(10〇11}^)十組〇(:11^(2.5)11^);除Control组外,各组分别加入相对应的药物,共同孵育24h。采用蛋白免疫印迹法,分别检测了NADPH氧化酶的亚基P47phox和gp91phox,炎症小体的相关蛋白ASC、Caspase-l和NLRP3还有肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、白介素-IP(interleukin 1(3,IL-lp)的蛋白表达水平。五、将BV2细胞分成5组:(l)Control组;(2)AngII(100nM)组;B)Losartan(ljiM)组;(4)如￡11(100111^)+1〇$311311(1_)组;(5)入1^11(1001^)+81〇〇11八(2.5_)除Control组外,各组分别加入相对应的药物,共同孵育24h。收集细胞上清液,采用ELISA法检测细胞上清液中TNF-a、IL_lp的含量。结果:(1)MTT实验检测结果:与对照组比较,Angll在浓度大于100nM时细胞的活力明显降低,会诱导细胞的凋亡。Griess法检测结果:Angll在浓度100nM时,BV2细胞上清液中NO的含量明显升高;综合以上两个检测指标,100nM的Angll为本实验的理想药物浓度。(2)DCFH-DA探针法检测结果:与Angll组比较,BiochA(1.25fiM、2.5^M、5pM)+AngII组,依次降低了细胞内ROS表达水平。其中选择BiochA的浓度为2.5pM作为适合的药物浓度。表明Bioch A降低BV2被Angll诱导激活后产生的ROS表达。(3)免疫蛋白印迹法检测结果:与Angll组比较,BiochA(2.5^M)+AngII(100nM)组没有降低ATI受体的蛋白表达水平。(4)免疫蛋白印迹法检测结果:与Angll组比较,BiochA(2.5^iM)+AngII(lOOnM)组下调了NADPH氧化酶的亚基P47phox和gp91phox的蛋白表达水平。表明Bioch A可以下调BV2激活后产生的P47phox和gp91phox。5)免疫蛋白印迹法检测结果:与AngU组比较,BiochA(2.5pM)+AngII(lOOnM)组BV2细胞中Caspase-1,ASC和NLRP3蛋白表达水平均有所下降且炎症因子TNF-cu IL-1 p和IL-6表达也有明显下调。6)ELISA检测结果显示:与Angll组比较,Bioch A(2.5^iM)+AngII(lOOnM)组BV2细胞上清液TNF-cu IL-lp的含量明显降低。结论:鸡豆黄素A抑制Angll诱导小胶质细胞的活化的机制可能是通过抑制NADPH氧化酶和NLRP3炎症小体的活性。