随着我国重工业的快速发展，重金属污染日益严重，尤其是土壤重金属污染，不仅导致农作物减产、品质下降，并可通过食物链进入人体，进而毒害人体健康。植物没有有效的选择性吸收这些重金属离子的能力，会在农作物可食部分累积。如果通过基因工程技术改变植物选择性吸收重金属离子的能力，并阻断在可食部分积累重金属，就有可能从源头上解决农作物重金属污染问题。但是，目前重金属离子进入植物细胞的通路、哪些基因参与响应重金属胁迫及这些基因在植物响应重金属胁迫中的功能尚不清楚。　　为了分离鉴定植物细胞中响应重金属胁迫基因，本实验室通过甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）研究重金属胁迫对植物基因组DNA甲基化水平的影响，克隆了255条差异片段，最终确定7条候选基因进一步研究。本论文通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、亚硫酸盐测序（BSP）和病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，分析这些基因在植物响应重金属胁迫中的作用，得到以下结果：　　（1）通过MSAP技术在本生烟草中得到255条Cd胁迫相关DNA差异条带，以此为模板构建克隆载体，测序分析后筛选出NbMORC3等7个与Cd胁迫相关的基因。　　（2）通过geNorm和NormFinder程序对ACT、TUB、18SrRNA、PP2A、GAPDH和 EF1a6个候选内参基因进行筛选，最终选择 EF1a作为不同浓度 Cd胁迫下qRT-PCR的最优内参基因。　　（3）通过qRT-PCR技术，研究候选基因NbMORC3等在不同浓度Cd胁迫下的表达情况，结果显示：随着 Cd浓度的上升，NbRL表达量先下调再上调，而NbMORC3表达量则相反；NbHGSNAT、NbMUT、NbBG、NbG1r和NbSAMD表达量均上调，除NbG1r在500 mg·L-1 Cd2+胁迫时表达量最高，其余均在250 mg·L-1 Cd2+胁迫时表达量最高。说明重金属Cd胁迫影响候选基因的表达水平。　　（4）通过亚硫酸盐测序（BSP）技术，研究候选基因在重金属胁迫甲基化变化情况，结果显示：在250、500 mg·L-1 Cd2+胁迫下，候选基因NbRL（280 bp）和NbG1r（330 bp）只有1处碱基位点发生变化为C-C-T-T（0/0-SO3/250Cd-SO3/500Cd-SO3）其余位点未发生变化，说明重金属Cd胁迫后诱导基因组DNA发生去甲基化，甲基化水平下降。其它候选基因的甲基化变化情况正在继续研究。　　（5）通过VIGS技术将候选基因的工程菌注射本生烟草，对沉默后2周植株进行半定量RT-PCR分析，结果表明：候选基因在VIGS沉默植株中的表达量明显低于对照植株，说明候选基因被成功沉默。对VIGS植物发育表型分析发现，多表现为植株矮小、生长发育迟缓、叶片小、薄且发黄，部分植株还出现凸状绿斑驳、叶脉出现坏死斑、叶尖向下弯曲呈钩状甚至出现焦枯状的坏死组织等症状。候选基因沉默后，植株的光合效率下降，对重金属的胁迫更加敏感。