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背景及目的:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)又称老年性黄斑变性,常伴有不可逆的视功能严重损害,是西方发达国家首位致盲性眼病,随着我国人口老龄化日趋严重,其患病率也日益增加。然而,AMD发病机制尚不十分明确,因此,研究AMD的发病机制迫在眉睫。RPE细胞对于维持正常视功能及眼底微环境有着重要作用。研究发现,RPE细胞功能障碍与AMD发病有关。随着年龄增长,RPE细胞脂褐素不断沉积,研究已证明,其主要成分A2E可导致DNA损伤。端粒位于染色体末端,与衰老密切相关,为DNA脆性位点,由此,我们推测,A2E可导致端粒DNA损伤,加速RPE细胞衰老,改变RPE细胞分泌表型,从而影响眼底微环境,为AMD的发病机制之一。因此,本课题主要探索A2E加速RPE细胞衰老及其相关机制在AMD发病中的作用,为寻找新的治疗靶点奠定理论依据。方法:本课题使用ARPE19细胞株。第一步,A2E孵育RPE细胞,经蓝光照射建立光损伤模型;通过MTT实验观察不同浓度A2E对于RPE细胞生长的影响,从而选择合适的干预浓度。进一步,通过Westernblot检测DNA损伤反应蛋白γ-H2AX的含量观察DNA损伤水平,通过comet assay验证DNA损伤情况;进而,通过免疫荧光观察DNA损伤蛋白γ-H2AX与端粒共定位,检测端粒DNA损伤情况;接下来,通过Q-FISH观察细胞分裂中期染色体末端端粒损伤类型。第二步,在体外建立A2E诱导RPE细胞的氧化损伤模型,通过β-Gal染色观察A2E对于RPE细胞衰老的影响;进而,在RPE细胞内转染端粒酶活性亚基h TERT,建立稳定转染h TERT-RPE细胞株,同时,加入A2E刺激,建立h TERT-RPE细胞株光氧化损伤模型,通过β-Gal染色观察细胞衰老情况,验证A2E加速RPE细胞衰老是否与端粒损伤有关。第三步,同上述方法,建立体外A2E诱导RPE细胞光氧化损伤模型,通过流式细胞仪检测A2E刺激RPE后细胞内ROS水平;接下来,加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)及抑制氧化应激水平,通过Q-FISH及免疫荧光观察端粒DNA损伤情况,通过β-Gal染色观察细胞衰老情况,验证A2E导致端粒DNA损伤及加速细胞衰老是否与氧化应激有关。第四步,建立体外A2E诱导RPE细胞光氧化损伤模型,加入类黄酮药物Chrysin(5,7-dihydroxyflavone),通过流式检测ROS水平,通过Q-FISH及免疫荧光观察端粒DNA损伤情况,通过β-Gal染色观察细胞衰老情况,验证类黄酮药物是否可缓解A2E导致的端粒DNA损伤及细胞衰老。第五步,建立体外A2E诱导RPE细胞光氧化损伤模型,通过Illumina平台进行RNA-deep Sequencing测序,通过DAVID ver.6.7(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)进行GO(Gene ontology)分析;进一步,通过RT-PCR进行差异表达基因验证。观察A2E刺激对RPE细胞表达谱的影响。第六步,同上述方法建立A2E光氧化损伤模型,通过Westernblot及免疫荧光观察NFκB通路激活情况,通过si RNA敲除细胞内P65观察共培养体系内细胞衰老情况,由此验证蓝光诱导A2E是否通过NFκB通路激活衰老相关分泌表型。结果:首先,蓝光诱导A2E可导致端粒DNA损伤,尤其导致端粒DNA缺失。其次,蓝光诱导A2E可加速RPE细胞衰老,且可通过转染端粒酶活性亚基修复端粒损伤来缓解。接下来,蓝光诱导A2E可导致RPE细胞内ROS含量升高,抗氧化物NAC可减低RPE细胞内ROS水平,且可部分缓解RPE细胞内端粒DNA损伤,部分延缓A2E加速RPE细胞衰老。紧接着,我们发现类黄酮药物Chrysin可缓解端粒DNA损伤,尤其缓解端粒DNA缺失,从而延缓RPE细胞衰老。最后,蓝光诱导A2E可通过NFκB通路促使RPE细胞产生衰老相关分泌表型,尤其如IL1B、IL3RA2、CXCR4、CXCL8等促炎因子高表达,从而改变视网膜微环境。结论:A2E可导致端粒DNA损伤,尤其端粒DNA缺失,加速RPE细胞衰老,从而使RPE细胞产生衰老相关分泌表型,导致IL-1β、IL3RA2、CXCR4、CXCL8等促炎因子高表达,改变视网膜微环境。抗氧化物NAC可部分缓解DNA损伤但非端粒特异性,类黄酮药物Chrysin可缓解端粒DNA损伤,从而缓解RPE细胞衰老,提示类黄酮药物Chrysin可特异性作用于端粒,为今后探索其在AMD防治中的可能性奠定基础。本研究提示A2E在RPE细胞衰老中的作用,进一步阐明了A2E导致RPE细胞表达谱的改变,影响视网膜微环境,是AMD发病的机制之一,为寻找新的早期AMD防治靶点提供理论依据和实验基础。