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背景:心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是一类严重威胁人类健康的重大疾病。由于心肌细胞难以再生,细胞替代治疗是未来用于治疗CVD的重要手段之一,而心肌细胞的来源和质量是实现细胞替代治疗的关键。诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)及其体外定向分化为心肌细胞(Induced pluripotent stem cells derived cardiomyocytes,iPS-CM)技术的出现,为研究心血管疾病、药物心脏毒性、治疗心肌损伤及心脏再生医学等带来了希望。尽管研究者们尝试了多种方法体外诱导人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPS)向心肌细胞(Cardiomyocytes,CM)定向分化,但尚存在着不同细胞系间分化效率不稳定、分化体系复杂、培养体系价格昂贵等缺陷。目前体外分化获得的hiPS-CM是多种亚型心肌细胞的混合群体,有必要建立一种单细胞培养体系为hiPS-CM表型分析、单细胞测序、细胞治疗等相关研究及应用提供细胞来源。研究方法:1.首先对所使用的hiPS通过碱性磷酸酶染色、RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞术等方法进行多能性鉴定,在此基础上,通过优化组合CHIR99021和IWP2抑制剂的剂量和时间,经单层诱导分化的方法高效诱导hiPS为成熟的、有自动节律的高纯度心肌细胞。2.通过在hiPS-CM的培养体系中添加不同浓度的ROCK激酶抑制剂Y27632,利用免疫荧光、结晶紫染色、CCK-8法检测Y27632对hiPS-CM细胞活力的影响;通过Brdu法检测Y27632对hiPS-CM细胞增殖的影响;采用流式细胞术、荧光定量PCR、蛋白质印迹(Western blot)等方法检测Y27632对hiPS-CM细胞凋亡及机制的影响。3.利用阿霉素(Doxorubicin,DOX)建立hiPS-CM损伤模型。通过CCK-8法检测不同浓度DOX处理24 h后对hiPS-CM细胞活性的影响;利用免疫荧光法检测DOX处理24 h后DNA损伤标志物γ-H2AX的表达;通过透射电子显微镜(TEM)观察细胞的亚显微结构;利用mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒感染细胞,检测细胞自噬水平;利用Western blot进一步检测DNA损伤、凋亡和自噬相关信号通路蛋白的表达变化。研究结果:1.hiPS碱性磷酸酶染色阳性,RT-PCR和免疫荧光染色结果证实其表达多能性基因,流式结果表明,hiPS细胞OCT4+为99.8%,证明hiPS具有正常的多能性。hiPS体外分化8 d左右出现搏动的心肌细胞,至大约10 d形成成片单层搏动细胞,选择分化30 d左右的细胞进行分析鉴定。RT-PCR结果表明,hiPS-CM表达TNNT2、TNNI3、MYL2和MYL7基因。免疫荧光染色结果显示,hiPS-CM表达心肌特异性结构蛋白cTNT和α-actinin。流式细胞术结果显示,Cardiac Troponin T(cTNT)阳性细胞率达96.79%。说明该单层分化法为高效稳定的hiPS-CM分化体系。2.不同浓度的Y27632均显著提高了 hiPS-CM的细胞活力,以10 μM浓度的Y27632促进效果最为明显(P<0.0001);免疫荧光染色结果表明,Y27632处理hiPS-CM 24 h后,cTNT+细胞数高于对照组;结晶紫染色及CCK-8结果显示,Y27632显著提高细胞存活率;Brdu结果显示,Y27632分别处理hiPS-CM 3 d和6 d后,Brdu+细胞显著高于对照组(4.88±0.07%vs 2.12±0.02%,5.7±0.12%vs 3.34±0.01%,P<0.0001),因此 Y27632 促进了 hiPS-CM 增殖。经流式细胞检测发现,hiPS-CM无血清悬浮培养3 d后,添加Y27632组细胞凋亡率为10±0.75%,显著低于对照组的 22.5±2.6%(P<0.0001),表明 Y27632 抑制 hiPS-CM 的凋亡。进一步检测抑制细胞凋亡的机制,RT-PCR和qPCR结果表明,经Y27632处理后,Caspase-3和Caspase-8表达显著下调(P<0.001),而Bax和Bcl-2表达无显著性差异(P>0.05);Western blot 结果显示,Y27632 处理后,Cleaved Caspase-3 和 Caspase-8 表达显著下调(P<0.001);Caspase-3活性检测分析也表明,Y27632处理后,显著降低了 hiPS-CM Caspase-3的活性(P<0.01)。因此,Y27632通过降低凋亡相关蛋白Caspase-3的表达和活性抑制了 hiPS-CM的凋亡。3.CCK-8结果显示,DOX可浓度依赖性降低hiPS-CM的细胞活力;免疫荧光染色结果表明,0.5μM DOX处理hiPS-CM细胞24 h后,表达γ-H2AX的阳性细胞数明显多于对照组;TEM检测结果显示,DOX诱导了 hiPS-CM自噬体增多,并导致细胞核破裂皱缩,促进了细胞凋亡;mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒感染后,DOX组有较亮的黄色荧光出现,且有明显的红色斑点;Western blot结果表明,随着DOX浓度的增加,p53和p21蛋白表达水平有所升高,促凋亡蛋白Bax表达上升,抗凋亡蛋白Bcl-2有所降低,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达上升,因此DOX诱导了 hiPS-CM的DNA损伤、自噬和凋亡。结论:本研究通过优化组合CHIR99021和IWP2抑制剂的剂量和时间,经单层诱导分化的方法,优化了 hiPS分化为CM的体系;通过在hiPS-CM的培养体系中添加ROCK激酶抑制剂Y27632优化了 hiPS-CM的培养体系;利用阿霉素建立了 hiPS-CM的损伤模型。因此,本研究为心脏毒性检测、药物筛选及再生医学领域等研究与应用奠定了基础。