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大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国北方沿海地区的优势海水养殖鱼类，但集约化养殖模式导致大菱鲆细菌性病害频发，其中弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)为大连地区养殖大菱鲆的关键病原之一。长期以来，水产养殖动物细菌性病害的防治主要依赖于抗生素，但随之带来药物残留、细菌耐药性和环境污染等问题。噬菌体作为一种生物制剂在水产养殖中应用已显示出其独特优势和巨大潜力。与抗生素相比，其具有专一性强、能自我复制增值、来源广泛且筛选方便等优势。本论文首次尝试应用裂解性噬菌体防治养殖大菱鲆弗氏柠檬酸杆菌感染，具体研究内容如下：
(1)弗氏柠檬酸杆菌噬菌体的分离、鉴定及生物学特性研究：以弗氏柠檬酸杆菌HZ-F为宿主菌，分离获得一株烈性噬菌体，命名为LV-1；扫描电镜观察显示其属肌尾病毒科(Myoviridae)，一步生长曲线结果表明LV-1的潜伏期为20min，裂解量为34；噬菌体LV-1显示较强的耐酸性，在pH3.0条件下孵育孵育120min，效价仅下降1.27log10PFU/mL。体外培养基中，噬菌体LV-1能有效裂解受试的3株弗氏柠檬酸杆菌分离株。噬菌体LV-1的贮藏稳定性受温度影响，其中在常温、4℃和-20℃条件下储存22周效价分别降低了1.78log10PFU/mL、0.39log10PFU/mL和1.63log10PFU/mL，故噬菌体在4℃条件下储存更稳定。噬菌体LV-1在饲料储藏中的效价随时间增加而降低。
(2)弗氏柠檬酸杆菌噬菌体基因组学研究：噬菌体LV-1为双链线性DNA，基因组大小为168842pb，G+C含量为38.6%，基因数为280，有4个tRNA。其中45个为已知功能基因，属于长尾噬菌体目肌尾噬菌体科的柠檬杆菌属噬菌体，且未发现整合酶、毒力因子和抗生素抗性基因，保证了其应用的安全性。
(3)弗氏柠檬酸杆菌噬菌的裂解活性研究：噬菌体在海水中对弗氏柠檬酸杆菌的裂解活性受温度和感染复数影响，其中温度为15℃时裂菌效果最好；而海水pH值(7.0~8.5范围内变化)对噬菌体裂解活性影响不显著，在海水中pH的变化对噬菌体抑菌效果无显著影响；在海水中感染复数对噬菌体效价有显著影响，且在MOI=100时抑菌效果最好。实验应用噬菌体LV-1对斑马鱼(Brachydanio rerio var)和大菱鲆进行体内攻毒保护实验。对斑马鱼腹腔注射5×106CFU/尾弗氏柠檬酸杆菌，攻毒后腹腔注射噬菌体在MOI=10时治疗效果显著(P＜0.05)，死亡率由70%降到20%，防治效果优于链霉素治疗。对大菱鲆腹腔注射1×106CFU/尾弗氏柠檬酸杆菌，攻毒后腹腔注射噬菌体在MOI=1时治疗效果显著(P＜0.05)，死亡率由66.7%降到0。而MOI=10时无显著差异，推测可能与噬菌体悬液中含有内毒素残留有关。实验采用活性炭吸附法对噬菌体悬液中内毒素进行脱除，结果显示脱除率为75%，但噬菌体效价也明显下降。
综上，本研究成功分离得到一株弗氏柠檬酸杆菌烈性噬菌体LV-1，系统研究了其形态特征、一步生长曲线、裂解活性和贮存稳定性，并完成了对其基因组特征的分析；在此基础上，通过体外和体内实验证实了其对弗氏柠檬酸杆菌感染的防治效果，为养殖大菱鲆细菌性病害的生物防治提供了新途径。
(1)弗氏柠檬酸杆菌噬菌体的分离、鉴定及生物学特性研究：以弗氏柠檬酸杆菌HZ-F为宿主菌，分离获得一株烈性噬菌体，命名为LV-1；扫描电镜观察显示其属肌尾病毒科(Myoviridae)，一步生长曲线结果表明LV-1的潜伏期为20min，裂解量为34；噬菌体LV-1显示较强的耐酸性，在pH3.0条件下孵育孵育120min，效价仅下降1.27log10PFU/mL。体外培养基中，噬菌体LV-1能有效裂解受试的3株弗氏柠檬酸杆菌分离株。噬菌体LV-1的贮藏稳定性受温度影响，其中在常温、4℃和-20℃条件下储存22周效价分别降低了1.78log10PFU/mL、0.39log10PFU/mL和1.63log10PFU/mL，故噬菌体在4℃条件下储存更稳定。噬菌体LV-1在饲料储藏中的效价随时间增加而降低。
(2)弗氏柠檬酸杆菌噬菌体基因组学研究：噬菌体LV-1为双链线性DNA，基因组大小为168842pb，G+C含量为38.6%，基因数为280，有4个tRNA。其中45个为已知功能基因，属于长尾噬菌体目肌尾噬菌体科的柠檬杆菌属噬菌体，且未发现整合酶、毒力因子和抗生素抗性基因，保证了其应用的安全性。
(3)弗氏柠檬酸杆菌噬菌的裂解活性研究：噬菌体在海水中对弗氏柠檬酸杆菌的裂解活性受温度和感染复数影响，其中温度为15℃时裂菌效果最好；而海水pH值(7.0~8.5范围内变化)对噬菌体裂解活性影响不显著，在海水中pH的变化对噬菌体抑菌效果无显著影响；在海水中感染复数对噬菌体效价有显著影响，且在MOI=100时抑菌效果最好。实验应用噬菌体LV-1对斑马鱼(Brachydanio rerio var)和大菱鲆进行体内攻毒保护实验。对斑马鱼腹腔注射5×106CFU/尾弗氏柠檬酸杆菌，攻毒后腹腔注射噬菌体在MOI=10时治疗效果显著(P＜0.05)，死亡率由70%降到20%，防治效果优于链霉素治疗。对大菱鲆腹腔注射1×106CFU/尾弗氏柠檬酸杆菌，攻毒后腹腔注射噬菌体在MOI=1时治疗效果显著(P＜0.05)，死亡率由66.7%降到0。而MOI=10时无显著差异，推测可能与噬菌体悬液中含有内毒素残留有关。实验采用活性炭吸附法对噬菌体悬液中内毒素进行脱除，结果显示脱除率为75%，但噬菌体效价也明显下降。
综上，本研究成功分离得到一株弗氏柠檬酸杆菌烈性噬菌体LV-1，系统研究了其形态特征、一步生长曲线、裂解活性和贮存稳定性，并完成了对其基因组特征的分析；在此基础上，通过体外和体内实验证实了其对弗氏柠檬酸杆菌感染的防治效果，为养殖大菱鲆细菌性病害的生物防治提供了新途径。