目的：　　 通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株进行的DNA甲基化及基因表达的实验研究,力求探讨DAPK基因甲基化在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲基化的状态,并分析两者之间的相关程度,为DAPK基因在急性白血病中的生物学功能的进一步研究奠定基础,为急性白血病的临床诊疗新思路提供理论依据。　　 实验方法：　　 1、标本的选取　　 标本选取急性白血病初发或治疗后复发确诊患者119例,其中男性51例,女性68例,中位年龄4l(19-76)岁。急性髓系白血病102例,急性淋巴细胞白血病17例。所有患者均参照《血液病诊断及疗效标准》第三版进行诊断,按照法英美协作组诊断标准(FAB标准)进行分组。选取血象正常非白血病患者为正常对照。　　 2、细胞的提取　　 肝素抗凝骨髓经淋巴细胞Ficoll-Hypaque液分离单个核细胞,用于下一步实验。　　 3、RNA提取及RT-PCR检测DAPKmRNA表达　　 用Trizol提取细胞总RNA,取约5～10×106细胞加入到灭菌的1.5ml塑料离心管中,加入1ml Trizol液,充分混匀,室温放置5分钟。加入氯仿0.2ml,震荡混匀15秒,室温放置3分钟,4℃11000rpm离心15分钟。缓慢吸取上层水相,加入到新1.5ml塑料离心管中,再向该新管中加入0.5ml异丙醇,混匀,室温放置lO分钟。4℃11000rpm离心10分钟,弃去上清,加入75967,醇0.5ml,充分洗涤管盖、管壁及管底沉淀。4℃7500rpm离心10分钟,缓慢充分弃去上清,用微量吸头吸取管中残留液体,室温干燥10分钟。加入经DEPC处理高压消毒的双蒸水6-15 ul,充分溶解RNA沉淀。所提取的总RNA溶解后用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。紫外分光光度计定量,要求2.0≥0D260/0D280≥1.8。RNA浓度换算成单位为μ g/μl.RNA终浓度稀释为3μ g/μl。cDNA第一链合成体系为25μl,用逆转录酶M-MLV,0ligo dT以及相关试剂按说明配成适当浓度,合成cDNA。　　 反转录成cDNA后运用RT-PCR法检测基因在白血病细胞及正常细胞中表达情况。实验试剂包括10×PCR缓冲液、dNTP、Taq DNA酶、引物和适当双蒸水,以内参照作为阳性对照,以去离子水替代DNA模本作为阴性对照。反应条件为95℃预变性5min,然后95℃延伸45S,退火温度为54℃45S,延伸温度为72℃45S,扩增28个循环,72℃延伸5min。扩增后将扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶仪上进行电泳1小时,GeneFinder染料染色,成像仪观察并摄像。　　 4、DNA提取与修饰及巢式甲基化检测DAPK甲基化　　 酚一氯仿法提取DNA,按文献方法进行DNA预处理保存。运用亚硫酸氢盐法对基因组DNA进行修饰,用Wizard(R)Genomic DNA纯化试剂盒对DNA进行纯化,方法按说明书操作。修饰所得产物即为模板进行MSP或-20℃保存。用巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)法对急性白血病患者DAPK基因启动子甲基化状况进行检测。第一轮反应条件为95℃预变性5min,然后95℃延伸30S,退火温度为55℃30S,72℃延伸30S,扩增35个循环,72℃延伸5min。将第一轮PCR扩增产物以1:50稀释取2μ L作为第二轮扩增的模板,其他体系成分同第一次PCR。第二轮反应条件为95℃预变性5min,然后95℃延伸30S,退火温度为甲基化产物61℃30S,非甲基化产物60℃30S,72℃延伸30S,扩增32个循环,72℃延伸5min。扩增产物在30g/L琼脂糖凝胶仪上进行电泳1小时,GeneFinder染料染色,成像仪观察并摄像。观察电泳结果,获得甲基化产物即可判定为甲基化阳性:得到非甲基化产物,且无甲基化产物判定该例标本为非甲基化:既未获得甲基化产物也未获得非甲基化产物则标志本次实验失败。　　 5、T载体克隆测序　　 从第二轮巢式MSP扩增出的随机产物中挑选2个随机引物,交予专业机构克隆后进行序列分析。　　 6、统计学分析　　 得到数据后应用SPSS13.0软件进行统计学分析处理,DAPK基因表达缺失频率,甲基化频率与白血病各亚型之间的差异应用Pearsons卡方检验进行数据分析,若P＜0.05为差异有统计学意义,若P＞0.05为差异则无统计学意义。mRNA表达情况应用Fishers精确检验。两者相关性分析采用Spearman秩和检验。得到最终结论。　　 实验结果：　　 DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPKmRNA相对含量的平均值为0.72±0.18,而在急性白血病病人骨髓标本中mRNA表达平均值为0.61±0.04,低于正常对照者,差异有显著性(P＜0.05)。其中52.94％(9/17例)的急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本DAPKmRNA表达降低或缺失,急性髓细胞性白血病病人数据为41.18％(42/102),基因表达降低或缺失与疾病各亚型无相关性(P＞0.05)。细胞株U-937基因正常表达,HL-60则表达缺失。采用N-MSP法分析表明,102例急性髓性白血病病人骨髓标本中33例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为32.4％(33/102)。17例急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本中8例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为47％(8/17)。7例正常人骨髓标本均为非甲基化,基因甲基化频率与疾病各亚型无相关性(P＞0.05)。细胞株U-937启动子区非甲基化,HL-60启动子区甲基化。ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPK mRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关(ALL组rs=-0.855,P＜0.05;.AM[组rs=-0.343,P＜0.05)提示两者有密切的关联。　　 讨论：　　 死亡相关蛋白激酶(DAP-kinase,DAPK)是一个细胞凋亡正调节子,能以P19ARF依赖的方式激活P53,抑制胚胎成纤维细胞的瘤性转化,激活caspase和导致DNA碎裂而引起细胞凋亡。研究证明,人类在多种癌症中DAPK基因表达出现低表达或者缺失。提示与癌症的发生发展有着密切的联系.DAPK基因启动子区CpG岛甲基化是DAPK表达缺失的一个重要机制。在白血病患者中已发现多种抑癌基因DNA异常甲基化而表达沉默,从而促进了疾病的发生与发展。对癌症相关基因启动子区甲基化状态的检测,已成为当今急性白血病发生机制的研究热点领域之一。针对目前常用的检测方法MS-PCR法灵敏度低,特异性较差的弊端。我们采用更高灵敏度的巢式甲基化PCR方法(N-MSP)来对急性白血病病人骨髓标本中甲基化及状况进行检测,力求使实验结果更加精确可信。同时采用RT-PCR法检测了DAPK基因表达情况。　　 本研究发现,DAPK基因在正常人骨髓标本中均有表达,其mRNA相对含量平均值为0.72±0.18,而急性白血病者平均为O.61±0.04,低于正常水平(P＜0.05)。其中52.94％(9/17)的ALL病人,41.18％(42/102)的AML病人骨髓标本DAPK表达降低或缺失,结果提示DAPK基因表达发生改变是急性白血病的常见现象。其阳性率基本与国内外报道一致。　　 本研究还发现41.1％(7/17)的ALL患者存在着DAPK基因启动子异常甲基化,高于目前的2个报道,但仍受时间实验条件等客观因素限制,未能进行大样本实验,其结果有待于进一步验证。在急性髓性白血病病人骨髓标本中32.4％(33/102)存在DAPK启动子区甲基化,目前国内外对于DAPK基因甲基化在AML中的阳性率报道不一,从10％至70％均有文献报道,考虑可能与种族差异及实验条件有关,下一步若条件允许应作多中心大样本临床试验来进行研究。ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPK mRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关(ALL组rs=-0.855,P＜0.05;AML组rs=-0.343,P＜0.05)提示两者有密切的关联。基本可认为启动子甲基化是基因mRNA失表达的促进因素。但在DAPK基因表达降低或缺失的人外周血标本中,仍有少数标本未发现DAPK基因启动子区甲基化,表明急性髓性白血病中基因启动子区的甲基化,并不是导致基因失表达的唯一原因,可能存在着其它的促进因素,有待于下一步实验进行证实。　　 在肿瘤中高频率出现的甲基化基因可以作为临床诊断、病程监控的分子标志物。而逆转DAPK基因的甲基化状态,恢复肿瘤细胞抑癌基因表达,使其去甲基化而被激活,从而抑制肿瘤发生发展。有可能成为一条新的肿瘤治疗途径。但DNA甲基化不是使其失活的唯一因素,应进一步深入研究如何增强DAPK基因的有效表达及其他导致基因表达沉默的机制,以期为急性髓性白血病的治疗提供新的前景。　　 结论：　　 DAPK基因异常甲基化是急性白血病发生发展过程中的频繁事件,与其mRNA的失表达呈显著负相关。可为急性白血病的发病机制的阐明提供新的依据。通过巢式MSP法检测急性白血病病人该基因的甲基化情况,可能会对疾病的预后分析提供一定的参考价值,具有一定临床意义。逆转DAPK基因的高甲基化状态有可能成为预防急性白血病发生,遏制疾病发展的新疗法。