猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的高度传染性疾病,给我国规模化养猪场带来了巨大的经济损失。PEDV毒株的基因变异使得现有的防控手段无法实现高效的免疫,寻找新的防控策略具有重要的研究价值。紧密连接相关蛋白在众多病毒的感染过程中发挥重要作用,PEDV感染导致猪肠道紧密连接受到破坏,结构紊乱,紧密连接参与PEDV的致病过程,导致继发性的细菌感染,因此维持紧密连接的完整性可能是预防PEDV的新策略。近年来,lncRNA作为在众多生物学功能中发挥重要作用的调控分子,具有作为分子标记物的潜力用于人类疾病的诊断治疗。从lncRNA调控机制出发筛选PEDV致病过程中调控宿主紧密连接的关键lncRNA,可以作为有效的遗传学手段,为进一步阐明PEDV的致病机理提供科学依据和实验支撑,同时筛选到的重要lncRNA可作为潜在的分子标记物应用于PEDV的抗病育种工作。本研究通过课题组前期筛选的PEDV感染的肠道屏障受损和健康的肠道屏障完整仔猪个体空肠粘膜进行lncRNA测序,利用生物信息学筛选结合荧光定量PCR验证初步筛选lncRNA446作为研究对象,并从细胞水平揭示lncRNA446通过紧密连接参与调控PEDV感染的分子机制,进一步在mRNA和蛋白水平筛选lncRNA446的互作分子,鉴定到Alix这一在组装和维持细胞紧密连接极性中发挥重要作用的互作蛋白,并通过构建干扰和过表达载体对Alix在PEDV感染中的功能进行了深入的验证,以期揭示lncRNA在PEDV感染宿主过程中的重要作用,为今后制定PEDV的抗病育种工作策略和筛选分子标记物奠定基础。1.筛选鉴定PEDV感染过程中调控紧密连接的候选lncRNA为了筛选在PEDV感染过程中调控紧密连接的关键lncRNA,本研究利用前期建立的极端表型样本进行lncRNA测序,共筛选到111个差异表达的lncRNA,其中上调表达lncRNA39个,下调表达lncRNA72个。随机挑选5个差异表达的lncRNA进行qRT-RCR对高通量测序的准确性进行验证,发现与lncRNA测序结果一致。本研究结合前期转录组测序数据基于cis和trans机制对测序筛选的差异表达lncRNA进行靶向预测并进行功能富集分析,发现靶基因主要被注释到代谢过程（metabolicprocess）、细胞部分（cell part）和结合（binding）等GO分类。KEGG分析主要被富集到核糖体（ribosome）、全身性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus）、醇中毒（alcoholism）和病毒致癌作用（viral carcinogenesis）等通路中。本研究密切关注的紧密连接信号通路也在KEGG分析富集的结果中,在此基础上,根据cis和trans机制的预测结果反向筛选了靶基因为紧密连接信号通路基因的差异表达lncRNA并利用qRT-PCR初步筛选lncRNA446作为PEDV感染后调控紧密连接的候选lncRNA。2.lncRNA446的亚细胞定位和功能验证本研究使用lncLocator、FISH试验和RNA核质分离qRT-PCR检测lncRNA446在猪小肠上皮细胞中的分布定位,结果表明lncRNA446主要在细胞质中表达。为了进一步研究lncRNA446的功能,使用siRNA干扰了 lncRNA的表达,通过PEDVM基因的拷贝数、TCID50、间接免疫荧光和Western blot等实验检测发现干扰lncRNA446后可以提高PEDV的复制增殖。构建DSS肠炎模型发现肠道受损12 h后lncRNA446的表达水平呈显著下调（P<0.05）。Transwell单层细胞模型发现lncRNA446干扰后TEER值极显著下降（P<0.01）。在此基础上,本研究检测了细胞上清液中的碱性磷酸酶含量,发现干扰lncRNA446后上清中的碱性磷酸酶含量极显著上升（P<0.01）,透射电镜发现lncRNA干扰48 h后IPEC-J2的TJ结构受到损伤,细胞间的间隙扩大。间接免疫荧光和Western blot检测ZO1的表达分布发现干扰lncRNA44648h后ZO1的表达明显下降,在细胞膜附近的表达受到破坏。通过CCK8实验发现lncRNA446干扰不同时间点IPEC-J2细胞的活性均呈极显著下降（P<0.01）,并且呈时间依赖性,干扰lncRNA446的表达后可以将IPEC-J2的细胞周期阻滞在G2期,并极显著提高IPEC-J2细胞的凋亡率（P<0.01）。3.lncRNA446抑制Alix泛素化降解进而调控紧密连接本研究通过转录组测序对lncRNA446干扰后mRNA的表达谱进行了筛选,结果显示lncRNA446干扰后380个基因表达存在显著差异,主要富集于病毒的防御反应（defense response to virus）、呼吸链复合体（respiratory chain complex）和泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）等显著富集的GO条目,以及甲型流感（Influenza A）、内质网中的蛋白质加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）和抗原处理和递呈（Antigen processing and presentation）等KEGG信号通路。通过RNAfold预测了 lncRNA446的二级结构,根据lncRNA446的二级结构将lncRNA446分成C端、N端和中间段分别进行RNApulldown,每段分别筛选到17、12和23个互作蛋白,其中C端中存在一个关键蛋白Alix,并且利用RIP反向验证了猪小肠上皮细胞中lncRNA446和Alix的结合。利用间接免疫荧光和Western blot实验发现lncRNA446干扰后可明显降低Alix的表达分布,使用MG132和Leupeptin处理提示lncRNA446介导Alix的降解位于蛋白酶体而非溶酶体。为了探讨lncRNA446是否介导Alix的泛素化,本研究分析了 lncRNA446干扰后IPEC-J2细胞Alix结合泛素的能力,结果显示lncRNA446干扰后Alix的泛素化水平上升,表明lncRNA446可能通过抑制Alix的泛素化水平进而介导Alix的降解。4.Alix在PEDV感染过程中的功能机制研究本研究利用CoIP验证了IPEC-J2细胞系中Alix与ZO1的互作结合,并且干扰Alix的表达后,通过Western blot检测发现ZO1在IPEC-J2细胞中的表达降低。为了进一步研究Alix在仔猪抵抗PEDV感染机制中的作用,本研究检测了 PEDV感染和健康仔猪个体中Alix的mRNA表达差异,结果发现PEDV感染后仔猪空肠粘膜中Alix的mRNA表达极显著上调（P<0.01）,对PEDV感染不同时间点的Alix蛋白表达进行Western blot和间接免疫荧光检测,结果发现Alix在PEDV感染48h呈现明显的下调表达,并且与F-actin的共定位结果显示Alix分布和表达趋势与F-actin具有高度的相似性。本研究成功构建了 Alix的干扰和过表达细胞系并在mRNA和蛋白水平进行了验证,可用于下一步的功能分析实验。F-actin的荧光定位显示Alix干扰后可以明显降低F-actin的表达分布,随后本研究利用PEDV感染Alix干扰和过表达细胞系评估Alix和PEDV感染之间的关系,PEDV拷贝数、间接免疫荧光和Western blot结果表明,干扰Alix后可以提高PEDV的复制增殖,过表达可以抑制PEDV的复制增殖。通过生物信息学分析Alix的三级结构并对Alix的泛素化位点进行预测后发现,在Alix蛋白质序列的332、344和695号氨基酸位点存在潜在的泛素化位点（SVM score>0.8）。本研究利用Alix在猪肠上皮细胞中进行免疫共沉淀实验结合质谱技术筛选Alix的互作蛋白,结果共筛选到226个Alix的互作蛋白。为了进一步筛选Alix的E3连接酶,本研究通过UBibrowser在线软件对Alix进行了预测,共得到37个潜在的E3连接酶,将预测结果与IP结果取交集鉴定到CRYAB这个可能在猪肠上皮细胞Alix的泛素化降解中发挥关键性作用的E3连接酶。