在中枢神经系统中,胆碱能调控是最重要的神经调控机制。神经递质乙酰胆碱（ACh）作用于其靶点毒蕈碱受体和烟碱受体实施胆碱能调控。烟碱受体又称尼古丁受体（nAChR）,是以同聚体或异聚体形式存在,其中最丰富的同聚体是α7-nAChR,它是大脑（尤其是海马体）中主要的nAChR亚型之一。α7-nAChR属于五聚体配体门控离子通道超家族,它通过打开可渗透阳离子的内在通道对其激动剂（如Ach,choline等）做出应答,即膜快速去极化从而打开α7-nAChR通道,导致钠和钙离子内流。大量化合物可通过作用于受体变构位点与之结合而不是结合激动剂和拮抗剂的正构位点来调节α7-nAChR的功能,其中α7-nAChR PAM属于这类化合物,PAM可在激动剂如ACh打开受体通道的条件下增强α7-nAChR的电流。与激动剂相比,α7-nAChR PAMs是更有前途的治疗工具。α7-nAChR作为重要的中枢靶点介导许多生理功能并参与许多神经系统疾病的发生和发展,但增强α7-nAChRs表达和功能是触发神经保护还是诱导神经毒性仍众说纷纭,产生神经保护还是神经毒性的条件仍不清楚,这将大大阻碍以调控α7-nAChRs为靶标的药物研发进程。解决这一问题将会使人们对α7-nAChRs的功能、药理和其在疾病发病和治疗上的作用有一个全新的认识,意义重大。本课题就针对这一科学问题进行了深入探讨。本实验的主要目的是探究增强α7-nAChR对海马神经元功能的影响。实验使用α7-nAChR的正向变构调节剂NS1738和PNU120596加α7-nAChR选择性激动剂（choline）,及慢性Aβ处理对原代培养的海马神经元的影响。本实验设置了α7-nAChR阈下浓度（1μM）、阈浓度（10μM）、阈上浓度（100μM）三个不同的激动剂（choline）浓度,分别控制实验条件在α7-nAChR通道未打开和打开两种情况,实验检测指标包括单细胞膜片钳记录、测定细胞乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）释放、免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术等。实验结果如下:1.应用MAP2和Hochest免疫荧光染色鉴定大鼠原代培养海马神经元成熟程度。结果显示,培养7天后大鼠原代培养海马神经元已成熟,可用于实验。2.单细胞膜片钳记录显示,阈浓度（10μM）choline不能记录到电流反应,而阈上浓度（100μM）choline可以诱发出一个小的内向电流反应,而10000μM choline可以诱发出典型的内向电流反应。3.用1μM choline与5μM NS1738共处理7天,与对照组（非处理组）比较,大鼠原代培养海马神经元LDH分泌减少（P<0.05）;大鼠原代培养海马神经元Bax/Bcl-2蛋白表达的比值降低（P<0.05）;大鼠原代培养海马神经元线粒体膜电位（△Ψm）升高（P<0.05）。用1μM choline与另一种PAM,PNU120596（1μM）共处理7天得到类似的结果。表明当choline浓度低于阈值不能打开α7-nAChR通道时,choline减少了大鼠原代培养海马神经元的自然凋亡。此时PAM不能发挥作用。4.用10μM choline与5μM NS1738共处理7天,与对照组（非处理组）比较,大鼠原代培养海马神经元LDH分泌明显减少（P<0.01）;大鼠原代培养海马神经元△Ψm显著升高（P<0.001）。用10μM choline与另一种PAM,PNU120596（1μM）共处理7天得到类似的结果。以上结果显示,10μM choline慢性处理对大鼠原代培养海马神经元不产生神经毒性,反而减少大鼠原代培养神经元的凋亡,与choline加上PAM的效应类似,之间没有统计学差异,结果表明,当choline浓度即使在阈值时（10μM）PAM仍不能增强choline的作用。5.与对照组（非处理组）比较,用100μM choline处理7天未见明显LDH水平的改变,但用100μM choline与10μM NS1738共处理7天,大鼠原代培养海马神经元LDH分泌明显增加（P<0.001）,且这种增强效应可被α7-nAChR阻断剂（MLA）阻断。用100μM choline与1μM PNU120596共处理7天,大鼠原代培养海马神经元LDH分泌明显增加（P<0.01）。这些结果表明,在choline阈上浓度打开α7-nAChR通道的条件下,PAM能通过增强α7-nAChR的功能产生明显的神经毒性作用。6.进一步利用慢性Aβ神经毒细胞模型检查PAM的效应。100 n M Aβ处理10天可导致大鼠原代培养海马神经元出现超兴奋,并可被α7-nAChR抑制剂MLA抑制。而在α7-nAChR基因敲除小鼠中并未观察到超兴奋（P<0.05）。结果显示,Aβ处理引起大鼠原代培养海马神经元超兴奋是通过α7-nAChRs介导。7.Aβ慢性处理大鼠原代培养海马神经元7天,与对照组（非处理组）相比,Aβ处理组LDH分泌增加（P<0.05）。Aβ与PAM共处理7天,与Aβ处理组相比,无论是choline（10μM）+NS1738+Aβ处理组、还是choline（10μM）+PNU120596+Aβ处理组大鼠原代培养海马神经元LDH分泌明显升高（P<0.05）;与choline+Aβ处理组相比,choline+NS1738+Aβ处理组、choline+PNU120596+Aβ处理组大鼠原代培养海马神经元LDH分泌明显升高（P<0.01）。结果表明Aβ慢性处理可使α7-nAChRs功能增强,此时PAM产生了毒性作用。8.用10μM choline与PAM共处理7天,与对照组（非处理组）相比,choline+NS1738处理组、choline+PNU120596处理组在给予去极化刺激时动作电位（AP）个数增加（P<0.05）;与choline处理组相比,choline+NS1738处理组在50 p A去极化刺激时AP个数增加,choline+PNU120596处理组在40-50p A去极化刺激时AP个数增加（P<0.05）。结果显示,10μM choline与PAM共处理可提高大鼠原代培养海马神经元兴奋性。以上结果表明,使用PAM增强α7-nAChR功能是减少大鼠原代培养海马神经元自然凋亡还是导致神经毒性取决于α7-nAChR通道是否打开。在通道没有打开的条件下,激活α7-nAChR（使用低浓度的激动剂）可减少大鼠原代培养海马神经元的自然凋亡,但此时PAM似乎不起作用。这一神经保护效应的机制可能是激活了α7-nAChR偶联的细胞内信号通路所致,值得进一步研究。在通道打开的条件下,激活α7-nAChR（使用较高浓度的激动剂）本身不引起神经毒性反应可能因为激活的α7-nAChR通道具有快速关闭的动力学特征。然而,此时用PAM或用Aβ慢性处理增加α7-nAChR的表达和功能后即可导致神经毒性作用,其机制包含了增强的α7-nAChR介导了神经元超兴奋和神经毒性作用。