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异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）催化三羧酸循环中的第二个限速反应,即催化异柠檬酸（isocitrate,ICT）脱氢脱羧生成NAD（P）H、CO2以及α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）。作为基础代谢酶,IDH分布于所有生物体中。依据其辅酶特异性,IDH可分为NAD+-依赖型IDH（NAD-IDH）和NADP+-依赖型IDH（NADP-IDH）。在真核生物中,NAD-IDH和NADP-IDH有着不同的生物学功能,前者主要参与能量代谢,后者主要参与合成代谢以及抵抗氧化损伤。根据氨基酸序列,IDH又可分为I型IDH（Type I IDH）和II型IDH（Type II IDH）,前者同时包含NAD-IDH和NADP-IDH,而后者仅发现NADP-IDH。分子系统学分析和实验室模拟的竞争性实验表明,在I型IDH中,细菌的NADP-IDH由NAD-IDH演化而来,是其为生成更多的NADPH以适应贫瘠环境的结果。如果这种类似的功能进化机制也适用于II型IDH,那么II型IDH中可能也存在NAD-IDH。前期的生物信息学分析已经显示,Type II亚家族中包含三个可能的NAD-IDH进化分枝,其中一枝为真核同源二聚体NAD-IDH,代表成员为单细胞绿藻Ostreococcus tauri（一种最小的真核生物）的IDH（简称OtIDH）。本论文对OtIDH进行了详细的酶学鉴定、辅酶特异性改造和高分辨率晶体结构的解析。1.OtIDH详细的酶学性质研究酶学研究显示,OtIDH是同源二聚体的真核II型NAD-IDH,分子量约为93 k Da,它对NAD+的特异性是其对NADP+的42倍(以Mn2+为激活剂)或51倍(以Mg2+为激活剂)。目前报道的真核NAD-IDH都是异源寡聚体,OtIDH是唯一的真核同源二聚体酶。另外,已报道的Type II IDH都是NADP-IDH,而OtIDH是具有古老表型的II型NAD-IDH。与细菌NAD-IDH不同,OtIDH的活性受底物的别构调节（nH≈2.0）,与真核异源寡聚NAD-IDH也不同,OtIDH对底物有非常高的亲和力(S0.5<10μM)。与植物NAD-IDH类似,NADH是OtIDH依赖于NAD+的活性的竞争性抑制剂（Ki=0.14±0.01 m M）,但未发现NADPH是其非竞争性抑制剂。以Mn2+或Mg2+为激活剂时,OtIDH的最适反应温度均为45°C,略高于单细胞莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的NAD-IDH（40°C）,但明显低于运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）的NAD-IDH（55°C）。当以Mn2+或Mg2+为激活剂,OtIDH的最适反应p H值分别为8.0和8.5,这与运动发酵单胞菌的NAD-IDH相类似。热稳定性实验显示,在42°C下孵育20 min,OtIDH的残余活性高于88%,但当超过这一温度时,OtIDH的活性开始迅速下降。OtIDH是金属离子依赖性酶。Mn2+为OtIDH活性的最佳激活剂,其次是Mg2+,其他二价离子(Co2+、Cu2+、Ni2+和Zn2+)及单价离子（K+和Na+）只有弱的或没有激活作用。Zn2+是OtIDH活性的强烈抑制剂,其他二价离子也有不同程度的抑制作用。单价离子对OtIDH的活性无明显影响。低浓度（0.01 m M或0.1 m M）的AMP或ADP或ATP、以及1 m M的ADP对OtIDH活性没有影响,但1 m M的AMP或ATP对OtIDH活性有部分的抑制作用。低浓度的α-KG（≤1 m M）对OtIDH活性无影响,但在高浓度时（≥5 m M）会部分抑制OtIDH的活性。L-谷氨酸虽然是某些真菌（如Neurospora crassa和Rhodosporidium toruloides）NAD-IDH的抑制剂,但是对OtIDH的活性无影响。2.OtIDH辅酶特异性的转换及其分子进化机制基于氨基酸序列比对,我们设计和构建了两个突变体酶,即单点突变体酶D344R和两点突变体酶D344R/M345H。凝胶过滤层析显示两个突变体酶仍维持二聚体状态,并且它们具有与野生型酶相似的圆二色谱结果,因此这些突变对OtIDH的聚合状态和蛋白质二级结构均无明显影响。酶动力学分析发现,突变体酶D344R和D344R/M345H对NADP+的特异性分别是其对NAD+的15倍和72倍,因此OtIDH的辅酶特异性通过定点突变实现了从NAD+特异性（古老表型）向NADP+特异性（适应性表型）的转变,其中单点突变体酶D344R的转换倍数为630倍,两点突变体酶D344R/M345H的转换倍数为3024倍。早期的研究已经证实,I型NAD-IDH的辅酶特异性转变是其适应环境的结果。作为II型NAD-IDH,将OtIDH的辅酶特异性从NAD+改造为NADP+,说明II型NADP-IDH的分子进化机制可能类似于I型NADP-IDH,即在进化历程中,为了满足贫瘠碳源环境中生物体对NADPH的需求,II型NAD-IDH也发生了辅酶特异性由NAD+向NADP+的适应性转换。因此,IDH的辅酶特异性进化机制具有普遍性。3.OtIDH晶体结构的解析通过单波长反常散射和分子置换法,我们解析了无配体结合的OtIDH及3种结合不同配体的OtIDH复合物的晶体结构,即OtIDH-Apo、结合NAD+和Mg2+的OtIDH(OtIDH-NAD+-Mg2+)、结合NAD+及柠檬酸（citrate,CIT）的OtIDH（OtIDH-NAD+-CIT）、以及结合ICT及Mg2+的OtIDH(OtIDH-ICT-Mg2+),其分辨率依次是1.75（?）、1.78（?）、1.87（?）和1.80（?）。结构相似性检索显示,OtIDH与II型NADP-IDH的结构相似性最高,它们都有相近的N端和C端的距离、2个α-螺旋的插入（α4和α11）,以及高度相似的钩状结构域。而结构比较表明,OtIDH与已解析的两个NAD-IDHs（细菌NAD-IDH和酵母NAD-IDH）在这3个方面（N端和C端的距离、2个α-螺旋的插入、钩状结构域）都存在较大的结构差异。根据复合物的晶体结构,可以鉴定所有与底物和辅酶NAD+相互作用的氨基酸残基。与细菌同源二聚体NAD-IDH相比,OtIDH底物结合口袋中的所有氨基酸十分保守,但NAD+结合口袋中的氨基酸与前者明显不同。值得一提的是,在三元复合物OtIDH-NAD+-CIT的晶体结构中,Lys283*（星号指另一个亚基的残基）独特地与NAD+腺嘌呤核糖的3’-羟基直接形成氢键。另外,4个晶体结构间的俩俩比较揭示了,OtIDH在结合配体之后,其活性位点和整体构象都存在大量的构象变化。基于结构的分析,OtIDH可能采用以Tyr159-Asp302-Lys234*为催化三联体的催化机制来催化反应。综合结构数据与分析,以OtIDH为代表的真核同源二聚体NAD-IDH很可能是真核同源二聚体NADP-IDH的祖先形式,且在贫瘠碳源的选择压力下,为了满足细胞生物合成对更多NADPH的需要,OtIDH具有演化为NADP-IDH的潜力。