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中成药是由数味乃至数十味中药材按一定治病原则配方制成的复方制剂。由于其组方复杂,生产、销售、使用等众多环节不够规范,质量标准不够客观具体;在经济利益的驱驶下,部分不法企业以假冒真、以次充好、减量投料,出现了投料与处方不符的问题。所以,对中成药各生物组分的鉴别及定量分析,是确保其用药安全及临床疗效的首要任务。传统用于中成药鉴别的方法有显微及理化鉴别等。近年来,越来越多的新方法新仪器运用到了中成药鉴别这一领域中,如色谱鉴别、光谱鉴别等。此外随着分子生物学及相关技术的迅猛发展,基于物种核酸序列分析的鉴别技术如雨后春笋之势发展起来。实时荧光定量PCR技术(简称Q-PCR技术)是以传统PCR技术为基础,将荧光基团添加于反应体系中,通过收集反应中产生的荧光信号以实现对整个PCR进程的监测,最后通过分析阈值循环数(Threshold cycle,Ct值)以及样品的标准曲线,来确定模板DNA的起始浓度,具有核酸杂交技术的特异性、传统PCR技术的灵敏性、光谱技术的精准性及简单操作性等特征。在本论文中,我们探讨了将Q-PCR技术应用于金龙胶囊中生物组分定性及定量分析的可行性。金龙胶囊是一种抗肿瘤中成药,以鲜守宫、鲜蕲蛇、鲜金钱白花蛇三种原料按2:1:1的比例组成。其制备过程中采取冷冻干燥等技术,最大限度地保留了遗传物质,为研究的进行提供了良好基础。一、金钱白花蛇荧光定量PCR法的建立1、目的基于COI序列设计金钱白花蛇高特异性引物,采用荧光定量PCR技术,对金龙胶囊中的金钱白花蛇组分进行定性及定量分析。2、方法2.1样本收集从湖南、广东及广西等地采集和收集金钱白花蛇及其混伪品样本。2.2高特异性引物设计依据引物设计原则,设计金钱白花蛇高特异性引物。2.3 DNA提取采用DNA提取试剂盒,按照制造商提供的方法,提取各样本DNA。2.4 COI片段扩增用COI序列通用引物对方法2.3提取的DNA进行COI片段扩增,设置空白对照组。PCR 反应体系为 10μl:DNA 模板 0.6μl;正、反引物各 0.3μl;2×TaqPlusPCR MasterMix5μl;ddH2O3.8μl。PCR反应循环参数:93℃预变性5min,55℃复性2min;93℃变性30s,55℃复性45s,70℃延伸45s(35循环);70℃:补齐5min。PCR反应结束后,电泳分析扩增结果。2.5金钱白花蛇高特异性PCR鉴别用步骤2.2设计的特异性引物对方法2.3提取的DNA进行特异性PCR扩增,设置空白对照组。PCR反应体系如2.4所述。PCR反应程序:94℃预变性5min,50℃复性2min;94℃变性30s,50℃复性50s,72℃延伸30s(30循环);72℃补齐5min。电泳分析扩增结果。按照上述方法,分别对退火温度、引物浓度及循环次数进行优化。2.6金钱白花蛇的荧光定量PCR鉴别参照步骤2.5优化的高特异性PCR鉴别条件对方法2.3提取的DNA进行荧光定量PCR鉴别,设置空白对照。PCR 反应体 20μl:DNA 模板 1.2μl;正、反引物各 0.6μl;SYBR@PremixEx TaqTM10μl;ddH207.6μl。PCR反应程序:94℃预变性30s;扩增反应25个循环(94℃变性30s,65℃复性50s,72℃延伸30s,每次延伸完后收集荧光信号);熔解反应(95℃ 5s,60℃lmin,95℃);40℃冷却。记录扩增曲线、熔解曲线、Ct值、Tm值等相关数据。2.7金钱白花蛇Q-PCR定量分析方法的建立2.7.1标准曲线的建立扩增银环蛇的COI片段,如方法2.4所述,将扩增体系扩大到50μl,其它条件不变;采用DNA纯化回收试剂盒,按照制造商提供的方法对PCR产物进行纯化。测定纯化后PCR产物的浓度,计算拷贝数,以拷贝数对纯化后PCR产物进行倍比梯度稀释。用稀释后的各DNA溶液为模板,参照步骤2.6的方法进行Q-PCR实验,记录相关数据。选取扩增正常的不同稀释倍数的样品,以样品拷贝数的对数值(以10为底)与相应Ct值进行线性回归分析,建立标准曲线。2.7.2所建方法的验证参照金龙胶囊投料比例制备供试品,以正伪品投料量设置全正品组、正伪品1:1组、正伪品1:4组、全伪品组四组实验,前三组分别设三组平行实验;按步骤2.3所述方法提取供试品中的DNA。以各供试品的DNA为模板,参照步骤2.6的方法进行Q-PCR实验,各供试品复孔一次,设置空白对照组,记录相关数据。3、结果3.1高特异性引物设计基于银环蛇COI序列设计了金钱白花蛇高特异性引物对,正引物COI37:5’-AATCG GAGCC TGTCT AAG-3’,反引物 COI337:5’-GACTG TTCAACCTGT GCC-3,。3.2 COI片段扩增金钱白花蛇及其混伪品原动物COI片段扩增产物电泳后,均得到约700bp长度的扩增带,空白对照组未见扩增条带。3.3金钱白花蛇高特异性PCR鉴别使用COI37/COI337高特异性引物对,在PCR程序为94℃预变性5min,65℃复性2min;94℃变性30s,65℃复性50,,22℃延伸303(25循环);22℃补齐5min的条件下,仅银环蛇样品扩增产物电泳后在300bp长度处出现目标条带,其它样品及空白对照品未见扩增带。3.4金钱白花蛇荧光定量PCR法鉴别利用高特异性引物COI37/COI337,在荧光定量PCR反应后,仅银环蛇样品出现特异性扩增曲线及熔解曲线,其它样品及空白对照未见扩增反应。3.5金钱白花蛇Q-PCR定量分析方法的建立运用以上方法,建立了用于金钱白花蛇定量分析的标准曲线,即y =-2.9247x+ 31.725,其中y为Ct值,x为拷贝数的对数值(以10为底);含有银环蛇的供试品(H1-H9)均有扩增曲线和熔解曲线生成,不含银环蛇的全伪品组及空白对照组未见扩增反应;全正品组、正伪品1:1组及正伪品1:4组所得银环蛇COI片段拷贝数依次为 5.722×106copies/μl、2.397×106copies/μl 及 1.138×106copies/μl,大致符合投料比。二、中国壁虎荧光定量PCR法的建立1、目的基于COI序列设计中国壁虎高特异性引物,采用荧光定量PCR技术,对金龙胶囊中的中国壁虎组分进行定性及定量分析。2、方法同“金钱白花蛇荧光定量PCR法的建立”所述。3、结果3.1高特异性引物设计基于中国壁虎COI序列设计出了该物种高特异性引物对,正引物GZG1:5’-GCAACTGACTAATCCCACT-3’,反引物 GZG2:5’-TGCTTCTTCTGGCGT AG-3’。3.2 COI片段扩增中国壁虎及其混伪品COI片段扩增产物电泳后,均得到约700bp长度的扩增带,空白对照组未见扩增带。3.3中国壁虎高特异性PCR鉴别使用GZG1/GZG2高特异性引物对,在PCR程序为94℃预变性3min;94℃变性30℃,57℃复性45s,72℃延伸30s(25循环);72℃补齐5min的条件下,仅中国壁虎样品扩增产物电泳后在150bp长度处出现目标条带,其它样品及空白对照品未见扩增带。3.4中国壁虎荧光定量PCR法鉴别利用高特异性引物GZG1/GZG2,在荧光定量PCR反应后,仅中国壁虎样品出现特异性扩增曲线及熔解曲线,其它样品及空白对照品未见扩增反应。3.5中国壁虎定量分析方法的建立运用以上方法,建立了用于中国壁虎定量分析的标准曲线,即y =-3.0127x +34.501,其中y为Ct值,x为拷贝数的对数值(以10为底);含有中国壁虎的供试品(H1-H9)均有扩增曲线和熔解曲线生成,不含中国壁虎的全伪品组及空白对照组未见扩增反应;全正品组、正伪品1:1组及正伪品1:4组所得中国壁虎COI片段拷贝数依次为 11.511×106copies/μl、6.416×106copies/μl 及 2.553×106copies//μl,大致符合投料比。三、蕲蛇荧光定量PCR法的建立1、目的基于《中国药典》中记载的蕲蛇高特异性引物,采用荧光定量PCR技术,对金龙胶囊所含的蕲蛇组分进行定性及定量分析。2、方法同“金钱白花蛇荧光定量PCR法的建立”所述。3、结果3.1 COI片段扩增蕲蛇及其混伪品COI片段扩增产物电泳后,均得到约700bp长度的扩增带,空白对照组未见扩增带。3.2蕲蛇高特异性PCR鉴别引物对(DK1/DK2),在PCR程序为95℃预变性30s;95℃变性30s,50℃退火1min,72℃延伸30s(25循环);72℃补齐5min的条件下,仅蕲蛇样品扩增产物电泳后在300bp长度处出现目标条带,其它样品及空白对照品未见扩增带。3.3蕲蛇荧光定量PCR法鉴别利用高特异性引物,在荧光定量PCR反应后,仅蕲蛇样品出现特异性扩增曲线及熔解曲线,其它样品及空白对照品未见扩增反应。3.4蕲蛇定量分析方法的建立运用以上方法,建立了用于蕲蛇定量分析的标准曲线,即y =-3.2617X +47.014,其中y为Ct值,x为拷贝数的对数值(以10为底);含有蕲蛇的供试品(H1-H9)均有扩增曲线和熔解曲线生成,不含蕲蛇的全伪品组及空白对照组未见扩增反应;全正品组、正伪品1:1组及正伪品1:4组所得蕲蛇Cytb片段拷贝数依次为 7.056×109copies/μl、4.166× 09copies/μl 及 1.668×109copies/μl,大致符合投料比。四、结论本研究设计高特异性引物,采用荧光定量PCR技术,首次建立了金钱白花蛇、中国壁虎、蕲蛇荧光定量PCR鉴别及含量分析的方法。该方法特异性好、灵敏度高,不仅可用于自制供试品中各生物组分的定性鉴别,还可用于其定量分析。