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龙钻通痹颗粒（Longzuantongbi Granules,LZTBG）是基于壮医特色“发旺”理论,针对活动期类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）开发的复方颗粒剂,目前已经取得广西药品监督管理局批准在广西中医药大学第一附属医院作为院内制剂使用,显示出良好的疗效。本课题组前期开展了关于LZTBG化学成分以及安全性有效性的评价研究,但是其在代谢水平上对机体的调控作用尚未明确。随着研究的不断深入,针对LZTBG“多成分”、“多靶点”的特点,进一步明确LZTBG的药效物质并阐明其作用机制是目前LZTBG临床应用的迫切需求,同时也是本课题的核心研究任务。本项研究采用UPLC-MS/MS技术及代谢组学分析方法,结合药效学实验和特征分子网络分析等,对LZTBG的化学成分进行了分析表征;对LZTBG单次给药正常大鼠后血浆中的入血成分进行深入分析,明确了其时间-浓度关系;开展了 LZTBG对正常大鼠与RA大鼠干预作用的代谢组学研究,探究LZTBG对正常大鼠、RA大鼠内源性差异代谢物的调控作用,进一步考虑LZTBG发挥药效时对RA大鼠的代谢调控影响,结合组间趋势判别和代谢通路网络分析,发现了 1 1个与药效相关的潜在生物标志物及其干预靶点,并阐释了其药效物质与潜在药效生物标志物的相关性。本课题的研究内容主要包括以下五个部分:1.基于UPLC-MS/MS技术和特征分子网络分析龙钻通痹颗粒的化学成分采用超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法,首先获得LZTBG的色谱和质谱数据,通过特征分子网络（Feature-based molecular networking,FBMN）分析,快速过滤、识别LZTBG的化学成分,并关联目标成分生成特征分子网络。利用这一分析策略,共发现并注释了 235个化合物,包括102个生物碱类化合物（异喹啉类生物碱73个、喹啉类生物碱14个、其他类生物碱15个）,72个黄酮类化合物（黄酮及黄酮醇类30个、二氢黄酮及二氢黄酮醇类15个、异黄酮类17个、查尔酮类6个、花色素及其他类4个）、18个香豆素类化合物、13个木脂素类化合物、6个苯丙素类化合物、1 1个有机酸类化合物以及13个其他类型化合物。其中,25个化合物经过标准品比对分析确认其结构。2.龙钻通痹颗粒单次给药正常大鼠入血成分分析基于自建的LZTBG化学成分信息表,采用UPLC-MS/MS方法分析了LZTBG单次给药正常大鼠后血浆中的药物原型成分,并考察其时间-浓度关系。结果表明,LZTBG单次给药正常大鼠时,在血浆中可检测到13个药物原型成分,主要包括9个生物碱类成分、1个香豆素类成分和3个有机酸类成分。其中,生物碱类成分的吸收入血速度较慢、在体内的代谢时间更长,这也为生物碱类成分可能作为LZTBG主要药效成分提供了依据。3.龙钻通痹颗粒对RA大鼠的药效学研究采用胶原诱导的类风湿性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）大鼠模型,干预给药31天,以大鼠体重、发病率、关节炎指数（Arthritis index,AI）、足肿胀程度、免疫器官指数与膝关节组织病理学变化,血清中细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-4的表达量等作为考察指标,从整体到分子水平对龙钻通痹颗粒干预给药的药效学进行系统评价。结果表明,不同剂量的龙钻通痹颗粒对RA大鼠具有潜在的预防和治疗作用,能够显著降低发病率和AI评分,改善RA大鼠膝关节内滑膜增生、炎性细胞浸润,减少骨与软骨的破坏以及血管翳的形成,降低血清中IL-1β、TNF-α的表达量。4.龙钻通痹颗粒对RA大鼠的代谢组学研究采用基于UPLC-MS/MS技术的代谢组学方法,分析了 LZTBG给药正常大鼠、RA大鼠后血浆中的药源性成分,明确了其剂量-浓度关系。同时,考察了 LZTBG对正常大鼠和RA大鼠血浆中内源性差异代谢物的调控影响。结果表明,LZTBG给药正常大鼠后,在血浆中发现23个药源性成分,主要包括15个生物碱类化合物和5个香豆素类化合物;给药RA大鼠后,在血浆中发现28个药源性成分,主要包括19个生物碱类化合物、6个香豆素类化合物和1个黄酮类化合物。由此可见,不同生理、病理状态的大鼠对LZTBG的吸收产生了一定程度的影响。继续采用代谢组学方法分析Normal、NLH、NLL组数据,发现LZTBG对正常大鼠血浆中32个差异代谢物存在调控作用,其中26个下调,6个上调;分析Model、LZTBL、LZTBH组数据,发现LZTBG对RA大鼠血浆中29个差异代谢物存在调控作用,其中22个下调,7个上调。进一步对Normal、Model、LZTBL组的数据进行整合分析,结合组间趋势判别和代谢通路网络分析,发现并鉴定11个与药效相关的潜在生物标志物,主要涉及亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢等9条紊乱的代谢通路,为揭示LZTBG干预RA大鼠的分子作用机制提供了重要依据。5.代谢调控相关性研究本研究比较了 LZTBG给药正常大鼠和RA大鼠后血浆中药源性成分的异同,及其给药后对内源性代谢物影响的差异,结合入血药源性成分的时间-浓度、剂量-浓度关系的汇总分析,明确了 LZTBG可能的药效成分及潜在药效标志物。进一步采用皮尔逊相关矩阵分析法对潜在药效标志物与药效成分、炎性指标之间的相关性进行了分析。推断出药效成分中喹啉生物碱只与脂质代谢相关的代谢物呈正相关;异喹啉生物碱不仅与脂质代谢相关的代谢物呈正相关,同时与氨基酸代谢和丁酸代谢相关的代谢物呈负相关;香豆素类化合物则主要与氨基酸代谢相关的代谢物呈负相关。推测出炎性指标中体重变化只与脂质代谢相关的代谢物呈正相关;IL-1β、TNF-α、足趾厚度主要与脂质代谢、氨基酸代谢相关代谢物呈正相关;关节炎指数评分只与脂质代谢相关代谢物呈负相关;组织病理学评分主要与脂质代谢相关代谢物呈负相关,同时与氨基酸代谢、丁酸代谢相关代谢物呈正相关。本项研究阐明了 LZTBG的潜在药效成分及其发挥药效的分子机制,并对发现的与LZTBG药效相关的潜在生物标志物的可靠性提供了佐证。