VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)家族共分为六个亚组,包括血管内皮细胞生长因子A、B、C、D、E及胎盘生长因子。其中,血管内皮细胞生长因子A是调节血管生成以及血管源性生长基因的核心因子。在VEGF-A基因的mRNA水平进行的选择性剪切可以产生不同的亚型,它们的相对分子质量从35至44kDa不等,每种因子的作用存在着差异,但都与促进血管以及淋巴等人体内脉管的生成以及分化有关。这些蛋白异构体相互之间在与肝素或硫酸肝素的结合的区域之间有所不同。在正常状态下,组织内同时存在着含量相对平衡的促血管内皮生长因子以及抗血管内皮细胞生长因子。这两种因子之间的平衡使得人体脉管可以正常的生成以及分化。VEGF-A作为一种高特异性的血管内皮细胞分裂素,可以促进蛋白从肿瘤相关的血管中溢出。对编码VEGF-A的基因进行干扰可以导致心血管系统在生成过程中产生严重的缺陷进而失调。缺氧是对VEGF-A表达进行上调的主要方式之一。在器官生成过程中的缺氧也被认为是诱导起源血管生成的基本方式。在另一方面,当组织中存在着VEGF-A剂量不足时,会导致器官发育被抑制的现象。此外,即使在氧气的存在下,VEGF-A的表达也可被一些其他的因子激活。例如在由ras-丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的信号转导通路中,被活化的致癌基因可以增强VEGF-A分子的mRNA表达水平。对VEGF-A信号通路的抑制可以抑制很多种类的肿瘤生长。除了作为内皮细胞特异性的生长因子之外,因其可以同时影响影响血管细胞以及神经细胞的功能,VEGF-A分子亦被分类为血管神经素。VEGF-A分子不仅在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中对突触可塑性起到了影响,在中枢神经系统以及外周神经系统中还对不同种类的神经细胞起到了保护作用。除此之外,在对于肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)的研究中发现的强力证据表明,VEGF-A分子与运动神经元直接存在着毋庸置疑的联系。肿瘤是人类生命健康的大敌,它们的分裂和生长需要大量养分,所以在肿瘤生长的部位会有大量不规则血管的生成。这是因为在有肿瘤存在的情况下,促血管内皮生长因子以及抗血管内皮生长因子的平衡被打破。多种致癌因素会导致促血管内皮生长因子的数量大幅提升,以致促血管生成的作用远远大于抗血管生成的作用。这种平衡的失调进而导致以血管为主的脉管大量生长,为肿瘤的生长提供了良好的环境。VEGF参与的信号通路异常促进肿瘤生成的途径可以主要总结为四步。第一,促血管内皮细胞生长因子的数量激增,打破它们与抗血管内皮细胞生长因子的平衡。第二,过多的VEGF与受体结合,产生一系列的细胞信号级联反应。第三,血管生长分化的异常。第四,促进肿瘤生长。故而对可调控VEGF基因表达的药物的研究,存在着重大的意义。由此我们可看出,对VEGF-A分子表达调控的研究,不仅可以阐明其表达调控的分子机制,同时也可以筛选一些与其表达调控相关的药物。因此无论对VEGF-A的基础研究,还是在对VEGF-A相关疾病的治疗中都具有十分重要的意义。目前采用的对该基因功能进行研究的方法主要是建立VEGF-A启动子调控的报告基因的表达载体,使用该载体转染细胞,建立该载体整合的细胞系,再用于其表达调控研究。但这样的方法存在着一定的缺陷,即这样的细胞系很难真正的反应细胞中内源性启动子的对VEGF-A的调控。靶向基因组修饰技术的发展,为对基因组进行精确修饰奠定了重要基础。基因打靶(gene targeting),可以通过使用人工核酸内切酶在基因组靶位点处引入双链断裂,进而激活细胞内源性的修复机制,使得外源性的DNA可以通过同源重组修复的途径整合入基因组靶位点中。通过这种技术,我们就可以在细胞基因组中VEGF-A内源性启动子下游,原位的整合一个报告基因。通过这种方式建立起来的细胞系可以更好的反映细胞内源性启动子的调控机制,从而可以使VEGF-A分子的功能以及其信号通路的研究进行得更为深入和精确。目前最为常用的三种人工核酸内切酶是:锌指核酸酶(zinc fingernuclease,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)以及 CRISPR/Cas(cluster regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated proteins)系统。它们在识别方式,特异性,组装难度等方面各有不同。TALEN核酸酶相对其它两种核酸酶来说,尽管有一定的组装难度,但特异性非常高。为此,本研究将采用TALEN靶向基因组修饰技术,在VEGF-A启动子的下游knock-in 一种敏感的报告基因,由此建立一种可以用于研究影响VEGF-A基因表达调控的细胞系,为后续VEGF信号通路的研究及肿瘤的临床治疗药物筛选奠定基础。本课题的具体研究内容如下:(1)靶向VEGF-A基因的TALEN核酸酶的设计、组装及活性测定:根据对VEGF-A内源性启动子表达调控研究的需要,我们设计了两种基因打靶策略。一种是将报告基因直接构建于VEGF-A分子内源性的启动子之后,当报告基因插入相应的位点之后,破坏了该条染色体上VEGF-A分子的表达;另外一种是将报告基因插入到VEGF-A分子的最后一个外显子之后,这样使得VEGF-A分子本身的表达不受到破坏。为此,我们通过查询VEGF-A分子启动子及其基因结构,使用ZiFiT软件信息,设计了满足上述两种打靶策略需要的针对两种不同位点的TALEN。为了获得上述设计的TALEN,我们首先确定TALES蛋白重复序列顺序,然后将TALEs小片段一一串联。经测序确认正确之后,将它们连入由本实验室保存并改造的载有TALEs蛋白N端、C端片段以及FokI核酸内切酶的腺病毒El穿梭载体中,由此获得相应的TALENs。然后将组装好的TALEN核酸酶表达载体转染入293细胞系,72小时后收取基因组,使用T7E1核酸内切酶酶切的方式,检测TALEN核酸酶的活性。(2)用于受VEGF-A内源启动子调控的报告基因打靶载体的构建:根据成功筛选出的TALEN核酸酶的切割位点,以及可使报告基因受VEGF-A基因内源性启动子调控的需要,我们分别设计了在VEGF-A基因启动子后以及末端插入荧光素酶报告基因的两种打靶载体。在紧接VEGF-A内源性启动子后的打靶位点中,我们设计的上游同源臂的末端恰好终止于VEGF-A基因启动子的最末尾,然后采用IRES(Intemal Ribosome Entry Site)元件与luciferase报告基因相连接,在此之后携带了表达eGFP及Neo抗性筛选基因的表达元件CMV-eGFP-T2A-Neo-pA。在下游同源臂外,为了便于后期对非特异性的随机整合进行负筛选,我们同时在打靶载体上连接了 TK筛选基因,从而获得第一种基因打靶载体。在设计的靶向VEGF-A基因末尾的打靶位点中,我们使上游同源臂,刚好终止于VEGF-A基因末端的终止密码子TGA之前,在同源臂后直接串联T2A自剪切小肽,隔开VEGF-A与luciferase基因,之后再次使用T2A隔开串联的Neomycin抗性筛选基因,组装获得第二种基因打靶载体。将通过以上方法获得的两种打靶载体进行质粒提取并保存,用于后续相应细胞系的建立。(3)携带受VEGF-A内源启动子调控的报告基因的VEGF-A promoter luciferase knock-in HEK293 以及 VEGF-A luciferase knock-in HEK293 细胞系的建立:将上述构建的携带有luciferase报告基因以及Neomycin正筛选基因的两种打靶载体,分别与靶向相应靶位点的TALEN核酸酶的表达载体共转染至293细胞系。转染完毕后根据打靶载体中携带的抗性基因分别使用用GCV以及G418药物进行正负筛选。待细胞系筛选稳定后,提取基因组,采用PCR以及测序的方式进行鉴定。在确认其进行了成功的整合后进行冻存,用于体外实验研究。(4)携带受VEGF-A内源启动子表达调控的报告基因的HEK293 knock-in细胞系的体外实验研究:经过鉴定后,我们得到两种使用内源性启动子对报告基因进行调控的 knock-in 细胞系:promoter VEGF-A luciferase knock-in HEK293 以及VEGF-A luciferase knock-inHEK293。分别裂解细胞收取裂解液,测定荧光素酶活性。通过上述研究,本课题获得了以下结果:(1)成功组装了靶向人VEGF-A基因启动子下游序列以及基因末端序列的两种TALEN核酸内切酶。构建了用于表达TALEN核酸酶的表达载体。并在基因组水平,验证了所构建的TALEN具有良好的切割活性。(2)成功构建了两种用于建立受VEGF-A基因启动子内源性调控的荧光素酶报告基因的细胞系的打靶载体。靶向VEGF-A启动子下游序列的打靶载体中,携带了 IRES-luciferase-SV40pA 报告基因元件以及 CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA正筛选元件。同时在同源臂外侧,该打靶载体还具有PGK-TK负筛选基因。靶向 VEGF-A 分子末尾的打靶载体中,携带了 T2A-luciferase-T2A-Neomycin-SV40pA元件,它并不含有负筛选基因。(3)成功将表达靶向人VEGF-A基因两个靶位点的TALEN表达载体同与之对应的用于介导基因重组的打靶载体共转至HEK293细胞系,并经过筛选得到稳定表达Neomycin抗性基因的两个细胞系:promoter VEGF-A luciferase knock-in HEK293细胞系以及VEGF-A luciferase knock-in 293细胞系。经过PCR以及测序鉴定,确定在两组细胞系中,均发生了成功的整合。(4)裂解经过PCR以及测序方式证明成功整合的promoter VEGF-A luciferase knock-in HEK293 细胞系以及 VEGF-A luciferase knock-in HEK293 细胞系。观测到通过基因组靶向修饰技术定点插入的荧光素酶报告基因在细胞内的表达。将荧光素酶活性较低的promoter VEGF-A luciferase knock-in HEK293通过有限稀释法进行克隆化。检测到克隆化后的细胞系,荧光素酶活性有明显提高。