造血干细胞作为造血系统的基石,具有自我更新和多谱系造血分化的能力,在个体的生命周期中可以持续产生各种谱系的血细胞,并重建受到损伤的受体造血系统。然而在胚胎发育中,造血干细胞数量稀少,发育时间窗短,并且目前缺乏对其特异性的表面标志物的认识,这使得深入研究发育造血干细胞的特性变得十分困难。目前研究表明,小鼠的造血干细胞是由主动脉-性腺-中肾区（Aorta-gonad-mesonephros region,AGM）背主动脉中一种特殊的内皮细胞亚群—生血内皮细胞在胚胎期第10天通过内皮向造血转化过程产生的,这一过程目前可以通过谱系示踪技术及实时成像系统在体内条件下观察到,更加明确了造血的内皮起源。目前已知小鼠AGM区中生血内皮细胞数量在胚胎期第10天达到高峰,随后逐渐下降;在胚胎发育过程中表达CD47、CD61、Dll4,此外,还表达Flk1、VE-Cadherin等内皮分子,缺乏CD41,CD43及CD45等造血分子的表达。Runx1作为内皮向造血转化过程中重要的转录因子,同样是生血内皮细胞的一个重要的标志物。因此,研究人员构建了Runx1+23GFP转基因小鼠来富集生血内皮细胞,同样,Gfi1-Tomato转基因小鼠也被用来探究生血内皮细胞的内皮向造血转化过程,但被这些分子标记的生血内皮细胞的造血干细胞潜能并没有得到证实。通过精确的单细胞转录组分析并结合体内功能实验验证,我们准确地用新构建的Neurl3-EGFP转基因小鼠捕捉到了具有造血干细胞功能的生血内皮细胞,进一步的通过CD41-CD43-CD45-CD31+CD201+Kit+CD44+（PK44）组合高效捕获了这群生血内皮细胞,同时在单细胞水平的体外功能实验上发现PK44细胞具有三种分化潜能,分别是单内皮潜能（约23%）、内皮和造血双向分化潜能（约2.7%）及单造血潜能（约40%）。在本研究中,我们探究了PK44细胞在造血干细胞出现前后的时空异质性和功能异质性特征。首先,我们通过对胚胎期第10天AGM区PK44细胞的单细胞转录组测序数据进行生物信息学分析,发现PK44细胞可以进一步划分为三个不同的亚群,其中两个亚群在分子表型上有明显区别,分别表现出内皮或造血偏向的特征,因此我们将这三个群体定义为内皮偏向群体、中间态群体及造血偏向群体。接下来通过分析这三个群体间的差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）,运用流式细胞仪索引分选（index sorting）模式并结合体外单细胞水平的功能实验筛选候选的可以区分PK44细胞功能异质性的分子,最终筛选到CD93及CD146这两个内皮相关分子,通过结合Kit与CD93或CD146的表达可以将PK44细胞群体划分为内皮和造血偏向的群体并可以较高效的富集其中的造血偏向群体,这一结果进一步在单细胞水平上的体外功能实验中得到了验证。接下来,我们发现在卵黄囊中也可以检测到PK44细胞的存在,通过分析在造血干细胞出现前后不同时间点的AGM/caudal half及卵黄囊PK44细胞特征,我们发现卵黄囊中PK44细胞表现出与AGM区相似的发育动态和功能多样性:在绝对数量上均是在胚胎期第10天达到高峰,随后逐渐下降;体外功能方面卵黄囊PK44细胞与AGM区一样,同样具有三种分化潜能,但内皮和造血双向分化潜能及单造血潜能比例均小于AGM区。同时我们发现卵黄囊PK44细胞群体在体外与OP9-DL1基质细胞共培养后,无论是造血簇的大小还是数量,均远远小于同时间点的AGM区细胞。重要的是,卵黄囊中的PK44细胞群体在体外与OP9-DL1基质细胞共培养后展现出明确的长期多谱系造血重建能力。虽然具有体外功能的相似性,卵黄囊中的PK44细胞群体表现出与AGM区中PK44细胞群体不同的转录组特征。综上所述,我们的研究描绘了以PK44为代表的生血内皮细胞的时空特征,并揭示了卵黄囊中之前并不为人所知的具有造血干细胞潜能的生血内皮细胞群体。这些发现为今后深入研究造血干细胞的不同起源和发育的分子机制提供了基础。