水稻OsSRT1生化功能分析

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Sirtuin蛋白家族是一类依赖于NAD的组蛋白去乙酰化酶,它存在于从细菌到人类的各种生物当中,并具有高度的保守性。Sirtuin家族具有广泛的功能,它与染色质沉默调控、细胞分裂、寿命调控、细胞凋亡与肿瘤抑制、能量代谢等生理过程都有密切联系。与酵母和动物的研究相比,有关植物Sirtuin蛋白生物学功能的研究鲜见报道。水稻(Oryza sativa L.)Sirtuin家族共有两个成员,分别命名为OsSRT1和OsSRT2,本论文主要从蛋白水平上对OsSRT1进行了生化功能的分析,主要结果如下:  1.从粳稻品种中花11中克隆得到OsSRT1基因,对其进行生物信息学分析,发现其定位与细胞核,与玉米ZmSIR2、拟南芥AtSIR2-1及人的SIRT6、SIRT7同源性较高,并推测其活性位点为第134位的组氨酸。  2.将OsSRT1连接到原核表达载体pGEX4T-2上,通过对诱导条件进行优化可得到可溶性的OsSRT1重组蛋白,并通过进一步的纯化,获得体外表达的OsSRT1活性蛋白,以便进行进一步的活性分析。  3.酵母共转化实验结果验证了OsSRT1能与组蛋白H3进行互作;通过HPLC分析,进一步验证体外表达的OsSRT1与组蛋白H3能在NAD存在的条件下进行酶促反应;而Western blot分析则进一步说明OsSRT1蛋白能与H3K9反应,使其去乙酰化。  4.对OsSRT1进行定点突变,获得突变体OsSRT1(H134L),利用原核表达系统技术和纯化技术,获得可溶性重组蛋白,再通过Western blot和HPLC分析检测其活性,发现其突变体的重组蛋白不具有组蛋白去乙酰化酶活性,结果说明OsSRT1的134位组氨酸为影响其活性的重要氨基酸。  5.利用Western blot对野生型幼苗和OsSRT1反义转化苗的不同部位的OsSRT1表达量和H3K9乙酰化水平进行分析,发现H3K9的乙酰化程度随着OsSRT1的表达量升高而降低,推测OsSRT1的表达量高低直接影响着H3K9的乙酰化水平。另外,野生型中,OsSRT1在根部的表达量最高,乙酰化水平最低,而在反义转化苗中则相反。  6.对野生型和反义转化苗进行表型观察,发现OsSRT1反义植株的发育要比野生型植株延迟,且反义植株的根部对比野生型均出现侧根较少及较短的表型。
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