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前言 新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿死亡和儿童永久性神经系统功能障碍的主要原因之一，新生儿HIE发病机制尚不十分清楚。近年来的一些研究表明，线粒体在HIE的发病过程中起关键性的作用，线粒体的主要功能为能量代谢，为各种生命活动提供能源。缺氧缺血(HI)后线粒体能量代谢异常在HIE的发生和发展过程中起主导作用。关于二次能量代谢衰竭的时间和程度报导不一，国外采用磁共振波谱学研究新生儿HIE的能量变化过程，动物模型以新生猪缺氧缺血脑损伤(HIBD)研究较多，目前国内关于新生儿和(或)新生动物HI后能量代谢变化研究报导的甚少，线粒体形态和功能变化与神经细胞死亡的关系尚不十分清楚。 本实验应用新生鼠HIBD模型，检测皮质神经细胞PCr、ATP、ATP+ADP+AMP的含量变化，动态反映HI后0h～72h，10个不同时间点的能量代谢变化过程，同时在透射电镜下观察线粒体在相应时间点的形态变化，将能量代谢状况与形态学的研究相结合，探讨线粒体和神经细胞形态变化与细胞能量代谢的关系，为将来HIE干预手段的研究奠定基础。 材料与方法 1．制作新生大鼠HIBD模型：7日龄Wistar大鼠，雌雄不限，体重11g-18g，行左侧颈总动脉结扎术，氧浓度8％，缺氧时间为1.5h，随机分组：假手术对照组(n=6)于假手术后恢复4h处死，HIBD模型组又随机分为10组(n=6)，分别于HI后0h、2h、4h、6h、sh＊oh、12h、24h、48h和72h处死。 2．标本留取：剥离左侧大脑皮质，在左顶枕部皮质取直径约2－3rum大小组织标本，放人2．5％戊H醛中固定，余下的左侧顶枕部皮质迅速置于一196℃液氮中，24h后移至一80℃冰箱中保存。 3．透射电镜检查：常规电镜制作过程，透射电镜观察线粒体形态及细胞超微结构。 4．融液相色谱方法检测皮质神经细胞内PCr人TP人DP和AMP的含量。 5．统计学处理：各组实验数据平均数的比较采用单因素方差分析对I组与对照组采用Tukey法检验。应用SPSS 10．0统计软件进行统计分析。 结 果 二．透射电镜观察结果 HI后加：线粒体结构基本正常，外膜大部分完整，部分模糊，崎内腔无明显扩大，基质内有轻度的电子高密度区。 HI后sh：胞浆内同时可见到不同程度损伤及正常的线粒体，损伤较重的线粒体外膜部分断裂，线粒体峙紊乱，基质分布不均匀，同时可见外膜完整、峻问腔小空泡变性的线粒体，也可见到呢消失、空泡变性的线粒体，还可见到外膜完整，峪结构清楚、基质分布较均匀的线粒体。 HI后24h：可见线粒体大部分溶解，结构模糊不清，同时可见细胞核膜断裂溶解，核仁可见。 HI后 48 h：细胞内可见空泡变性的线粒体，细胞器大部分溶解，结构模糊，细胞间界线不清，细胞核溶解，核仁消失。 2．PCr ＊TP和 A＊＋ADP＋AMP的结果 PCr于 HI后立即下降对I后 6h下降到对照组的 50．78％，明 ·2·显低于对照组（P＜0．of）。于＊后10 h恢复到正常对照组的9二．93呢，与对照组比较无明显下降（P＞O．05人于＊后2油出现第二次下降，为对照组的58．06畅，明显低于对照组（P＜O．01入 ATP于＊后立即下降，HI后Zh下降到对照组的71．36％，明显低于对照组（P＜O．01人于＊后12h恢复到正常对照组的83．05呢，与对照组比较无明显下降（P＞o．05人于＊1后48h出现第二次下降，为对照组的61．10％，明显低于对照组门＜O．01八 ATP＋ADP＋AMP于 HI后立即下降，为正常对照组的 50．14畅，明显低于对照组（P＜O．01人于＊1后sh恢复到对照组的8293畅，与对照组比较无明显下降河＞o．05人于＊后阶卜第二次下降，为对照组的32．56％，明显低于对照组（P功对门。 讨 论 1．缺氧缺血后线粒体形态改变 本实验研究表明线粒体在HI后立刻出现轻度外膜的损伤，于HI后 8 h在胞浆内同时出现不同程度损伤的线粒体和结构正常的线粒体，在此时间点细胞内高能磷酸物质部分恢复，表明线粒体氧化磷酸化的功能部分恢复，虽然存在部分损伤的线粒体，但对整个细胞ATP的含量影响不大。 在HI后24h和48h，线粒体损伤达到高峰，同时出现细胞浆溶解、细胞核溶解、核仁消失，呈现细胞坏死的形态学改变。本实验观察结果表明，线粒体损伤的严重程度与皮质神经细胞损伤有密切联系，而且线粒体及细胞损伤的严重程度与皮质神经细胞内高能磷酸物质的下降相一致。 入HI后线粒体生成ATP的功能发生改变 本实验研究结果表明新生大鼠HI后皮质神经细胞内这些高能磷酸物质存在二次下降，衡量线粒体功能的指标有很多，包括线 ·3·粒体合成ATP的能力、线粒体呼吸控制比（RCR人组成呼吸连的酶和辅酶的活力和含量，本实验通过检测细胞内 PCr、ATP、ATP＋ADP＋AMP反映线粒体能量代谢的功能，表明线粒体功能在 HI过程中发生改变，关于HI后线粒体损伤的机制尚不十分清楚，早期损伤?